丁香浸提液对亚硝酸盐清除作用

殷坤钰，谢微*

贺州学院食品科学与工程技术研究院（贺州 542899）

亚硝酸盐是一种性状与食盐非常相似的无机含氮盐，俗称工业用盐。亚硝酸盐普遍分布在食物，像甜菜、白菜、菠菜、芹菜及萝卜等绿色蔬菜中，亚硝酸盐含量极高[1]，甚至有研究表明，人类摄入亚硝酸盐有80%以上源于蔬菜[2]。亚硝酸盐在人类生活中广为使用，如在建筑业中用作防锈剂；在工业中用作丝绸和麻布的漂白剂；在食品工业中用作食品添加剂[3]。亚硝酸盐给工业、建筑业和食品工业带来巨大经济价值。但同时也给人类健康带来危害，它不仅能使人中毒，还具有严重致癌性。生活中一般食品都有硝酸盐，在微生物亚硝基化菌的作用下还原形成亚硝酸盐。据研究表明[4-5]，亚硝酸盐属于强氧化物，长期摄入的亚硝酸盐进入血液后会把血色素中的二价铁氧化成三价铁，产生大量高铁血红蛋白，从而使血液载氧能力下降，进一步导致高铁血红蛋白症。同时，可造成血管和血压下降，导致外周血液循环障碍。亚硝胺含量达到一定量时，可在人体内诱发一系列疾病，如胃癌、直肠癌、食管癌和肝癌等[6]。亚硝酸盐与胺类化合物不但在试验室和自然条件下能合成亚硝胺，而且在人体和动物体内也能合成亚硝酸胺，但在人和动物的胃中更适合合成亚硝胺[7]。

丁香（Clove）是一种干燥花蕾，属于桃金娘科被子植物，有雄丁香、丁子香、支解香、鸡舌香等4个别称，是中国重点开发研究的药材之一，也是受人熟知但日常食用率极少的一种香辛料之一，是一种药食两用植物。研究发现，丁香具有抗氧化、抑菌防腐、温中降逆、行气止痛、温肾等药理作用[8]。此外，在国家公布的87种药食两用的原料中，丁香的抗氧化能力最强并位列首位，其中抗氧化活性的主要成分为多酚和黄酮化合物[9]。据郭艳华[10]研究表明，丁香总多酚含量与其总抗氧化能力、清除超氧阴离子和抑制脂质过氧化能力之间有显著相关性。

近些年来，以香辛料为亚硝酸盐清除剂的试验研究增多。调查发现，研究趋势从抗坏血酸（VC）转移到富含VC、类黄酮和多酚类、有机硫化物等还原性物质的天然植物[11]。其中，有洋葱[12]、大葱[13]、山药[14]、绿茶[15]、香辛料等富含VC、VE、茶多酚和有机硫化物的天然植物，它们具有清除亚硝酸盐和阻断

亚硝胺合成能力，达到防癌目的。香辛料的种类繁多，其中对亚硝酸盐清除试验的香辛料出现最多的是大蒜[16]、花椒[16]、生姜[17]、辣椒[18]等，也有以丁香为亚硝酸盐清除剂的试验研究，但均混合其他香辛料。同时，香辛料对亚硝酸盐清除试验中大多探讨将提取液与亚硝酸盐直接反应测定亚硝酸盐清除率的影响因素。此外，也有侧重于探讨原料提取工艺的研究，但单独以丁香为亚硝酸盐清除剂的试验尚未发现。因此，试验以丁香为原料、超纯水为溶剂，采用水浴提取法提取丁香有效物质，研究最佳提取工艺，并将提取的丁香浸提液用于消除亚硝酸盐的研究，以期为进一步开发利用丁香或天然有效的亚硝酸盐清除剂提供参考理论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丁香（山东公丁香，产自山东枣庄，用组织粉碎机粉碎备用）。

冰醋酸（成阳市科龙化工试剂厂）；对氨基苯磺酸（广州化学试剂厂）；盐酸（西陇科学股份有限公司）；亚硝酸钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；盐酸萘乙二胺（天津市大茂化学试剂厂）；试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

Evolution 300紫外可见光分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司）；DFY-600摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司））；DK-98-ⅡA单列四孔电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FA2004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂的配制方法

对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：将称取的2 g对氨基苯磺酸和少量20%的盐酸溶液充分搅拌溶解，用20%盐酸溶液定容至500 mL，避光保存。

亚硝酸盐标准溶液（25 μg/mL）：准确称取0.5 g亚硝酸钠固体，溶解后定容于100 mL容量瓶中（作为储备液），采用逐级稀释法稀释溶液至25 μg/mL。

盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：准确称取1 g盐酸萘乙二胺，溶解后定容至500 mL，避光保存。

1.3.2 丁香浸提液的制备

依照文献[19]方法提取并略作修改：称取10 g粉末状的丁香和150 mL蒸馏水在250 mL锥形瓶中搅拌均匀，置于45℃恒温水浴锅下水浴3 h，用循环水真空泵过滤、静置，所得滤液备用。

1.3.3 标准曲线的绘制方法

从亚硝酸盐储备液中分别吸取几个不同体积梯度（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0和3.0 mL）于100 mL容量瓶中，定容，制成不同浓度亚硝酸盐标准溶液。分别吸取2 mL置于50 mL容量瓶中，加入4 g/L对氨基苯磺酸溶液2 mL，摇匀，静置4 min，加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水定容至刻度。静置15 min，于波长538 nm处测定吸光度。以纵坐标为吸光度，横坐标为溶液浓度绘制标准曲线。

1.3.4 亚硝酸盐清除率的测定方法

取25 μg/mL NaNO2溶液2 mL和15 mL丁香浸提液依次加入50 mL容量瓶中，混匀。加入4 g/L对氨基苯磺酸溶液2 mL，摇匀，静置4 min，加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水定容至刻度。静置15 min，于波长538 nm处测定吸光度。严格按照上述步骤重复3次，并按式（1）计算丁香中亚硝酸盐清除率。

式中：A1为未加丁香浸提液的吸光度；A2为加丁香浸提液的吸光度。

1.4 丁香浸提液最佳工艺条件的优化试验

1.4.1 单因素试验的测定方法

1.4.1.1 浸提时间的测定方法

把6个250 mL锥形瓶中分别加入10 g丁香粉末样品和150 mL蒸馏水，混匀，做好标签。置于45℃恒温水浴锅中分别浸提0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0 h后过滤，取上层滤液，分别测定其亚硝酸盐的吸光度并计算其清除率。

1.4.1.2 料液比的测定方法

取6个250 mL锥形瓶分别加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 g丁香粉末状样品和150 mL蒸馏水，混匀，做好标签。分别置于45℃恒温水浴锅中浸提一定时间后过滤，取上层滤液，分别测定其亚硝酸盐的吸光度并计算其清除率。

1.4.1.3 浸提温度的测定方法

取6个250 mL锥形瓶按一定的料液比加入，混匀，做好标签。置于30，35，40，45，50和55℃恒温水浴锅中分别浸提1.5 h后过滤取上层滤液，分别测定其亚硝酸盐的吸光度并计算其清除率。

1.4.2 正交试验方法

通过试验结果可知，丁香浸提液提取的条件对亚硝酸盐清除率的影响有浸提温度、料液比、浸提时间等3个因素，现以这3个因素中选取适当的水平进行L9(33)正交，因素水平设计见表1所示，以丁香浸提液的制备条件进行优化试验。

表1 丁香浸提液的制备条件正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐清除率的测定结果

根据表2的数据，由式（1）计算亚硝酸盐清除率最终结果为20.300%。

表2 亚硝酸盐清除率的测定结果

2.2 亚硝酸盐标准曲线

亚硝酸盐的标准曲线如图1所示。

由图1的标准曲线可知，亚硝酸盐标准溶液的回归方程为A=0.017 7C+0.073 1，相关系数R2=0.997 3，线性较好。

图1 亚硝酸盐的标准曲线

2.3 丁香浸提液制备工艺的单因素试验结果

2.3.1 浸提时间对亚硝酸盐清除率的影响测定

在设定料液比1∶15（g/mL），浸提温度45℃反应条件下，不同浸提时间提取的丁香浸提液对亚硝酸盐清除作用的效果见图2。

结果表明，在设定好的料液比1∶15（g/mL）、浸提温度45℃条件下，浸提时间在0.1～1.5 h，丁香浸提液对亚硝酸盐清除率随着时间延长而逐渐增加，说明在此时间段，丁香浸提液的有效成分提取的效果越来越好。浸提时间增加至1.5 h时，其清除率达到83.08%且为整个反应体系中最高。浸提时间超过1.5 h时，亚硝酸盐清除率不再呈现增加趋势。可能的原因是在一定范围内，浸提时间延长可使丁香有效成分不断从丁香中释放，但浸提时间延长到一定时间后，有效成分的扩散速度逐渐减慢或已基本溶出，随着浸提时间继续增加，丁香浸提液对亚硝酸盐清除率反而降低。因此，选择浸提时间1.5 h为宜。

2.3.2 料液比对亚硝酸盐清除率的影响测定结果

在设定浸提时间1.5 h，浸提温度45℃反应条件下，不同料液比提取的丁香浸提液对亚硝酸盐清除作用的效果见图3。

料液比1∶150～1∶42（g/mL）时，图3中呈现先升后降趋势。料液比1∶150～1∶100（g/mL）时，亚硝酸盐清除率在两者之间有少量下降，但总体上来说差别不大，波动现象不太明显。料液比增加到1∶75（g/mL）时，其清除率呈现上升状态并达到最高值。料液比1∶60～1∶42（g/mL）时，清除率出现下降趋势。说明过多的丁香添加量不仅没有提高丁香浸提液清除亚硝酸盐的效果，反而还会降低亚硝酸盐清除率。因此，选择料液比1∶75（g/mL）为最佳。

图2 丁香浸提时间对亚硝酸盐清除率的影响

图3 丁香料液比对亚硝酸盐清除率的影响

2.3.3 浸提温度对亚硝酸盐清除率的影响测定结果

在设定料液比1∶100（g/mL），浸提时间1.5 h反应条件下，不同浸提温度提取的丁香浸提液对亚硝酸盐清除作用的效果见图4。

结果表明，在已设定前提条件的反应体系中，随着浸提温度延长，丁香浸提液对亚硝酸盐清除率呈现二降一升的变化趋势。浸提温度30～40℃时，丁香浸提液对亚硝酸盐清除率随着温度升高而出现逐渐下降状态。浸提温度40～50℃时出现缓慢上升。浸提温度大于50℃时清除率又会出现下降趋势，原因是一些具抗氧化性质的物质不稳定，温度升高时导致丁香中一些抗氧化成分遭到破坏。因此，选择浸提温度50℃为宜。

2.4 丁香浸提液提取的正交试验结果

丁香浸提液的最佳提取工艺的正交试验结果及方差分析结果见表3和表4。

极差值的大小反映了各因素对丁香浸提液提取效果的影响，极差值大，该因素对丁香浸提液提取效果的影响力越大，反之越小。由表3中R所示，A的极差值最大，其次是B和C。有表4方差分析结果可知，丁香浸提液制备的3个影响因素对亚硝酸盐清除率均没有达到显著水平。

图4 丁香提取温度对亚硝酸盐清除率的影响

表3 丁香浸提液最佳提取工艺优化的正交试验设计与结果

表4 丁香浸提液提取正交试验方差分析

在最佳提取工艺条件A3B1C3，该优化工艺条件与正交试验里的试验号7一样。在经正交验证可得，此最优条件下提取的丁香浸提液对亚硝酸盐清除率分别为88.69%，88.69%和88.89%，平均的亚硝酸盐清除率为89.10%。

3 结论

丁香的生理活性作用有很多，但主要的还是防腐抑菌，抗氧化等。丁香属于香辛料的一种，在食品加工过程中，不仅能起到调味作用，同时通过试验确定丁香能够消除亚硝酸盐含量和阻断亚硝胺合成。试验中，不同条件如浸提时间、料液比、浸提温度等提取的丁香浸提液，均会影响到其清除亚硝酸盐能力。采用水浴提取法提取丁香有效物质，以单因素试验和正交试验，得到最佳提取工艺：浸提温度55℃、料液比1∶100（g/mL）、浸提时间1.5 h。在此条件下进行最优验证，可知提取的丁香浸提液对亚硝酸盐清除率可达89.10%。