潘桦丽,张镖*,丘利霞,付裕
中山大学新华学院药学院(广州 510520)
《中华人民共和国药典》(2015年版)收载的紫草(Arnebiae Radix)为紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物的干燥根,分为新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst),或内蒙紫草(Arnebia guttataBunge)[1]。田佳鑫等[2]通过考证得出,历代《中华人民共和国药典》《中华本草》《中华药海》等书皆称新疆紫草为软紫草,紫草、滇紫草、内蒙紫草均属硬紫草。
据文献[3]报道,紫草中含有萘醌类、单萜苯酚及苯醌类、酚酸及其盐类、生物碱类、脂肪族及酯类化合物等多种化学成分,其中脂溶性萘醌类是主要生物活性成分,具有消炎抗癌、抗肿瘤、杀菌抗病毒、降血糖、保肝和免疫调节等药理作用。主要药效成分紫草素类具有抑菌、抗炎、抗氧化等功效。张帅等[4]通过试验对比水浴、超声、微波3种常用提取方法,得出微波提取法在快速提取方面有显著优势。试验主要对新疆软紫草和硬紫草中紫草素微波提取工艺进行优化,并对2种紫草的紫草素含量进行比较。
软紫草(产地新疆,批号1801001,广州市岭南中药饮片有限公司);硬紫草(产地广东,广州市清平药材批发市场);乙醇(广州化学试剂厂)。
MARS6微波消解萃取仪(CEM);UV-6000型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司);FA2104分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。
1.3.1 工艺流程
紫草→前处理→称量→微波提取→抽滤→定容→测吸光度
1.3.2 紫草前处理
软紫草、硬紫草,经50℃烘干,粉碎,过3号筛,备用。
1.3.3 含量测定
精密称取2.0 g紫草粉末,加入一定量对应体积分数的乙醇溶液,置微波消解萃取仪中提取,冷却至室温后减压抽滤。取一定量滤液置25 mL容量瓶,加95%乙醇溶液定容,得供试品。在紫外分光光度计516 nm下,95%乙醇作空白对照,测定吸光度。根据朗伯-比尔定律推算比较2种紫草提取液中紫草素含量。
紫草素含量=色素质量(g)/紫草质量(g)×100%
1.3.4 单因素试验
根据单因素随机区组试验设计方法,分别精密称取2.0 g软紫草粉末、硬紫草粉末,分别改变提取温度(50,60,70,80和90℃),乙醇体积分数(50%,60%,70%,80%和90%),提取时间(5,7,9,11和13 min),料液比(1∶6,1∶9,1∶12,1∶15和1∶18 g/mL)的条件进行微波提取,优选各因素提取软紫草、硬紫草的工艺条件。
1.3.5 正交试验
根据单因素试验结果,分别选取提取温度、乙醇体积分数、提取时间、料液比的最佳工艺条件,对软、硬紫草分别建立L9(34)正交表,因素水平见表1和表2。比较2种紫草中紫草素含量,并根据色素含量优选提取工艺条件。
表1 软紫草色素正交试验因素水平表
表2 硬紫草色素正交试验因素水平表
2.1.1 提取温度对提取结果的影响
在500 W功率下,按料液比2∶25(g/mL)分别加入95%乙醇溶液,分别在不同温度下提取5 min,取滤液定容,以95%乙醇作参比液,在516 nm下测吸光度,根据朗伯-比尔定律计算紫草素含量。结果见图1。对于软紫草,提取温度50~70℃时,色素含量随着温度上升而增大,提取温度大于70℃时,色素含量随着温度上升而减小;对于硬紫草,色素含量随着温度上升而增大。因此选择软紫草的提取温度70℃、硬紫草90℃较适宜。
2.1.2 乙醇体积分数对提取结果的影响
在500 W功率下,分别用不同体积分数的乙醇溶液,按料液比2∶25(g/mL),在70℃下提取5 min,取滤液定容,以95%乙醇作参比液,在516 nm下测吸光度,根据朗伯-比尔定律计算色素含量。结果见图2。对于软紫草,色素含量随着乙醇体积分数增大而增大,乙醇体积分数90%时色素含量最大;对于硬紫草,乙醇体积分数低于60%时,色素含量随着乙醇体积分数增加而增大,乙醇体积分数高于60%时,色素含量随着乙醇体积分数增加而减小。因此选用90%乙醇溶液提取软紫草、60%乙醇溶液提取硬紫草较适宜。
图1 提取温度对提取结果的影响
图2 乙醇体积分数对提取结果的影响
2.1.3 提取时间对提取结果的影响
在500 W功率下,按料液比2∶25(g/mL)加入95%乙醇溶液,在70℃下分别提取不同时间,取滤液定容,以95%乙醇作参比液,在516 nm下测吸光度,根据朗伯-比尔定律计算色素含量。结果见图3。对于软紫草,提取时间5~8 min时,色素含量随时间增加而显著减小,提取时间大于8 min时,色素含量随时间增加无明显变化。对于硬紫草,提取时间小于9 min时,色素含量随着时间增加而增大,提取时间大于9 min时,色素含量随着时间增加而减小。因此选择软紫草提取5 min、硬紫草提取9 min较适宜。
2.1.4 料液比对提取结果的影响
在500 W功率下,按不同料液比加入95%乙醇溶液,在70℃下提取5 min,取滤液定容,以95%乙醇作参比液,在516 nm下测吸光度,根据朗伯-比尔定律计算得色素含量。结果见图4。对于软紫草,色素含量随着溶剂量增加而减小,但料液比达到1∶12(g/mL)之后,色素含量随着溶剂量增加而增大。料液比1∶18(g/mL)时提取率2.56%,是料液比1∶6(g/mL)时(提取率2.43%)的1.05倍,故微波提取软紫草色素的最佳料液比1∶18(g/mL)。对于硬紫草,色素含量随着料液比增大而减小,料液比达到1∶15(g/mL)后,色素含量变化不大,因此选择料液比1∶6(g/mL)较适宜。
图3 提取时间对提取结果的影响
图4 料液比对提取结果的影响
根据单因素试验结果与分析,对提取软硬紫草的提取温度、乙醇体积分数、提取时间、料液比进行L9(34)试验,结果见表3和4。根据紫草素含量优选提取工艺条件。
由表3正交试验直观分析数据可知,RB>RD>RC>RA,所以各因素对软紫草色素含量的影响程度关系为:乙醇体积分数>提取时间>料液比>提取温度。微波提取软紫草色素最佳方案为B3D3C1A2,即:乙醇体积分数90%、提取时间9 min、料液比1∶12(g/mL)、提取温度80℃。由表4正交试验直观分析数据可知,RB>RA>RC>RD,所以各因素对硬紫草色素含量的影响程度关系为:乙醇体积分数>提取温度>料液比>提取时间。微波提取硬紫草最佳方案为B1A2C2D3,即:乙醇体积分数60%、提取温度80℃、料液比1∶9(g/mL)、提取时间13 min。在各组提取条件下,软紫草色素含量均高于硬紫草色素含量。在相应最佳提取工艺条件下,软紫草色素含量2.65%是硬紫草色素含量0.63%的4倍。
表3 软紫草正交试验结果
表4 硬紫草正交试验结果
精密称取软紫草、硬紫草分别按B3D3C1A2、B1A2C2D3进行试验,平行操作3次,所得提取液紫草素含量均值分别为2.49%和0.61%,分别高于对应正交试验表中其余试验组的紫草素含量,与正交试验结果相吻合,因此微波提取软紫草、硬紫草色素的最佳工艺稳定可行。
随着社会变迁、技术进步和对健康的关注,安全、绿色、无毒、来源广的天然色素掀起开发和应用高潮。紫草素是多种萘醌类色素总称,不仅可作为药物,也是一种天然色素,可用于食品、医药、化妆品和印染等领域,具有较大开发应用前景。微波技术提取天然色素,能强化浸提过程,具有高效率、高选择性、环保、耗时少、低能耗、成本低等优点,适用面更广。选取软、硬2种紫草进行紫草素的提取试验,在微波提取技术中含量最高的是软紫草,色素含量达到2.49%,适作为紫草素的提取原料,最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数90%、提取时间9 min、料液比1∶12(g/mL)、提取温度80℃。该工艺稳定可行,重现性好、色素得率高。