滨海湿地土壤微生物群落多样性及其影响因素

张爱娣, 郑仰雄, 吴碧珊, 黄东兵

(广东生态工程职业学院, 广州 510520)

生态系统能够维持一个完整的链条，需要各种的物质资源，由此带来了一系列的物种循环与能量流动。土壤质量反映了陆地生态系统的健康状况，土壤中的微生物和养分含量，都能通过一定的聚集和分级作用，作用于土壤质量。其中，土壤微生物的作用较大，能够加速分解有机质，促进形成土壤腐殖质，丰富土壤养分和促进其循环等，使土壤在环境监测、土壤肥力、土地利用等方面的指标得以提升，维持土壤生态系统的生物化学特征[1-6]；与此同时，土壤微生物能够对土壤养分进行分解和转化，使土壤维持能量流动和物质循环，提高质量和健康状况。再以往的研究中，困于微生物学的技术和方法，学界大多从微生物数量方面研究土壤，通过研究微生物的多样性，明确土壤微生物在组成和区系上的变化[7-8]。而随着一系列生物和化学测试技术的进步，土壤微生物的多样性被人们越来越深入地认识到，一般使用磷脂脂肪酸(PLFA)分析法、碳素利用法和核酸分析法，从功能、物种和遗传多样性等角度展开研究。其中，碳素利用法主要通过Biolog微平板进行，由于其在微生物群落变化时表现比较明显，所以通过探查Biolog代谢多样性，理清其类型和群落结构而达成目标。所以通过该技术，能够研究和发现土壤微生物群落的代谢和其功能的多样性。

珠江三角洲湿地在形成过程中，受到河口周边地质构造、地形地貌、河口水动力过程、海平面变化等外在因素的印象，在珠江与海洋的交汇之地形成的，是珠江入海口与海洋相互作用的产物，并形成了独特的河口三角洲地貌格局[9-15]。在长期的发展演变过程中，海平面的上升导致随珠江入海的泥沙在河口湾大量沉积，促进了珠江三角洲的形成，主要表现为，在河口处堆积形成了大量浅滩和滨海湿地，大量细颗粒沉积物向河口湾外集中并形成了大面积的水下三角洲及粤西陆架泥质沉积体[16-17]。但是，从20世纪80年代以后，由于经济的飞速发展，引发了珠江三角洲地区自然生态环境的变化，湿地面积逐渐缩小，滨海湿地退化严重，众多湿地景观被破坏，该地区的环境质量急剧下降，生物的多样性也逐步丧失，这给珠江三角洲地区带来了巨大的环境压力，也使该地区的环境保护与适度开发利用呈现不平衡的状态[18]。在这种情况下，研究湿地土壤微生物多样性显得十分必要。因此，本研究主要集中在对滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落多样性及其影响因素等方面的探究，为我国的湿地环境综合治理与保护提供必要的借鉴和参考价值。

1 材料与方法

1.1 采样点分布

研究区选择珠江三角洲的淇澳岛，面积约为24 km2，由于地处珠江河口内西岸横门河口，所以盛行南亚热带海洋性气候。经统计数据显示，该地区1月平均气温为15.3℃，历年极端最低温为2.4℃，常年平均气温为22.4℃；该地区的潮汐则呈现不正规半日潮的特征，主要表现在，涨落潮历时不等，相邻的两个高潮或低潮的潮高不等，平均潮差随洪季、枯季及大、小潮而不同，一般为0.7～1.9 m；另据数据调查和分析发现，影响广东的热带气旋每年平均多达12次，其中，有50%的热带气旋显示在广东登陆，而有21%的热带气旋显示在珠江口登陆。

1.2 样品采集

选择了淇澳岛上的芦苇湿地、红树林湿地、互花米草湿地和碱蓬湿地，并在每个湿地选择3个重复样地，在2015年8月—2018年8月期间，在每个样地选择5个20 m ×20 m代表方，用于采集土壤样品，同时，使用直径为4 cm的土钻按混合采样法获得0—20 cm土层，并将5个采集点的土壤混合形成土样，再用四分法将定量的土壤置于封口袋中，放入冰盒带回实验室。带回实验室的土样分为两部分使用，风干、磨细一部分土样，过100目筛用于测定土壤理化性质；置于4 ℃温度中保存另一部分土样，以作为分析土壤微生物群落功能多样性之用。

1.3 土壤微生物群落功能多样性

土壤微生物能够使土壤保持活性和肥力，可以从McIntosh，Shannon和Simpson指数等角度进行多样性测定；而在测定Simpson指数时，务必要放大数据至一千倍，避免出现负数；在分析多样性时，首先要确认无菌的环境，称取等同于烘干状态下10 kg重量的土壤，加入90 ml NaCl溶液，使其浓度达到0.145 mol/L，继续振荡半小时，将样品稀释至1 000倍，继而使用BIOLOG排枪从土壤溶液中取出100 μl，用ECO板进行接种后再进行初次读数，再将其放在25℃环境中培养216 h，注意每间隔12 h进行一次读数；然后使用0.85%NaCl无菌溶液稀释样品，并将其放置在25℃下的Biolog-Eco板进行培养，注意在此过程中要媒体都读取吸光值[19]。

由于Biolog-Eco板中的碳源种类繁多，大约有31种，为准确探究微生物的利用水平，本研究采取了平均颜色变化率(AWCD)的研究方式。研究表明，当土壤微生物对碳源的利用水平越高时，AWCD值越大，并且具有刚大的丰度，该值的计算公式如下[20]：

AWCD=Σ[(Ci-R)/31]

式中：Ci代表第i孔的吸光值；R表示对照孔则；若(Ci-R)<0，则计算过程中将之记为0，即(Ci-R)≥0。

土壤微生物对土壤肥力的保持具有重要的推动作用，其群落功能多样性的测量，一般通过3个指数测定实现：McIntosh指数、Shannon多样性指数和Simpson指数[18-19]。

H=-∑Pi(lnPi)

式中：H表示物种丰富度指数；Pi表示微平板相对吸光值，计算公式为:

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

S=被利用碳源的总数(当吸光值≥0.25的情况下微孔总和)

Ds=1-∑Pi

式中：S表示碳源利用丰富度指数；Ds表示优势度指数。

想要得到相应的光密度值，需要培养96 h才能实现，然后用主成分法对其进行分析，在本试验中，共提取了2个主因子，再继续分析微生物对碳源的利用水平。

统计分析：Excel 2007和SPSS 21.0进行数据分析和显著性水平检验。

2 结果与分析

2.1 滨海湿地不同植物群落土壤养分

滨海湿地不同植物群落土壤pH变化范围在7.13～7.56，基本表现为：互花米草湿地>碱蓬滩湿地>芦苇湿地>红树林湿地，其中不同湿地植物群落土壤pH值差异均不显著(p>0.05)；土壤有机碳变化范围在9.63～13.98 g/kg，基本表现为：互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，其中芦苇湿地和红树林湿地差异不显著(p>0.05)，二者显著高于互花米草湿地和碱蓬滩湿地(p<0.05)；土壤全氮变化范围在0.91～1.18 g/kg，基本表现为：互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，其中不同湿地差异均显著(p<0.05)；土壤全氮变化范围在26.52～43.09 g/kg，基本表现为：互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，红树林湿地显著高于其他湿地(p<0.05)(图1)。

2.2 滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落代谢平均颜色变化率

微生物群落功能多样性不仅与土壤微生物群落的生态功能具有较强的相关性，更能体现土壤微生物群落的生态功能，作为反映土壤微生物群落利用碳源能力的重要指标，平均颜色变化率(AWCD)在一定程度上体反映土壤微生物的代谢活性。在滨海湿地，培养不同的植物群落土壤时，要注意每隔24 h测定AWCD值，就能得到AWCD随时间的动态变化图(图2)。观察动态变化图能够发现，滨海湿地不同植物群落土壤微生物碳源利用与培养时间呈正比例发展关系，会随着培养之间的增加而增加。在开始培养的24 h内，AWCD变化不甚明显；但在培养的24～72 h内，碱蓬滩湿地、互花米草湿地、红树林湿地和芦苇湿地中的土壤微生物碳源利用AWCD快速增长，说明微生物在这个阶段活性较强；培养时间达到72 h后，AWCD增长速度减慢；而在192 h后，又开始急剧增长。具体来说，培养时间在48 h之内时，滨海湿地中不同植物群落土壤微生物碳源利用基本保持一致的态势；而培养时间超出48 h之后，在某时间段内，土壤微生物碳源利用的情况为红树林湿地>芦苇湿地>碱蓬滩湿地>互花米草湿地，只是在局部有所波动。

2.3 滨海湿地不同植物群落土壤微生物对碳源利用强度

土壤群落总体的改变，是由土壤微生物的多样性而引起的，但是通过该信息无法得知微生物群落代谢的情况，但是了解微生物对碳源的利用情况，能发现一些端倪。研究土壤微生物群落代谢的多样性，可使用光密度增加较快的120 h的AWCD值进行分析。从化学基团的性质出发，将ECO板上的31种碳源分成氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、聚合物、胺类、酚酸类等6类。如果对碳源进行培养，时间越久，微生物对其的利用数量也会越来越多。

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，下同。

图1 滨海湿地不同植物群落土壤养分

图2 滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落代谢平均颜色变化率

由表1可知，对于碳源的利用，不同的微生物之间的区别一般比较大。以滨海湿地为主要考察地域来看，不同植物群落土壤微生物对碳源的利用率也大不相同。通过试验发现，红树林湿地中的土壤生物对碳源的利用率最高，互花米草湿地中的土壤生物对碳源的利用率最低，芦苇湿地和碱蓬滩湿地居中，且芦苇湿地中的土壤生物对碳源的利用率小于红树林湿地大于碱蓬滩湿地。其中，对碳水化合物类的利用比率变化范围为0.79～1.46，利用羧酸类的比率变化范围为1.02～1.51，利用聚合物类的比率变化范围为0.65～0.99，利用胺类率变化范围为0.17～0.37，对酚酸类利用率变化范围为0.61～0.71。概而言之，滨海湿地不同植物群落土壤微生物的主要碳源，除了碳水化合物、羧酸类碳外，还包括氨基酸类、酚酸类、聚合物类和胺类碳源等种类。

2.4 滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落多样性

由图3可知，滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落功能多样性指数存在一定差异，土壤微生物物种丰富度指数(H)变化范围为1.63～3.35，基本表现为互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，其中不同湿地差异均显著(p<0.05)；土壤微生物均匀度指数(E)变化范围为0.24～0.75，基本表现为互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，其中互花米草湿地和碱蓬滩湿地差异均不显著(p>0.05)；优势度指数(Ds)变化范围变化范围为0.686～0.701，基本表现为互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，其中不同湿地差异均不显著(p>0.05)；碳源利用丰富度指数(S)变化范围为7.15～16.79，基本表现为互花米草湿地<碱蓬滩湿地<芦苇湿地<红树林湿地，其中不同湿地差异均显著(p<0.05)。

表1 滨海湿地不同植物群落土壤微生物对碳源利用强度

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

图3 滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落多样性

2.5 土壤微生物群落碳源利用类型的主成分分析

在处理数据降维时，可以考虑使用主成分分析法。主成分分析法可以被用作对多个变量进行线性变换，并选择出少个数重要变量。在分析滨海湿地不同植物群落根区土壤微生物群落功能的差异时，要从31种碳源的利用情况出发进行分析。明确试验对象的主成分(PC)分析(PCA)后，选取第120小时时间点的数据，明确4个主成分。其中，主成分1，2能分别解释变量方差的69.286%和84.156%，前3个主成分之和为94.197%，所以，本文主要阐释前3种成分。对主成分进行分析后可知，3个主成分载荷31个碳源，见表2，如果主成分载荷的碳源分子越多，受到的影响就越大。由表3可知，与第一主成分密切相关的碳源总数为18种，占据种类数量最多的为碳水化合物，达6种；其次为羧酸类化合物，达5种；接着是多聚化合物、氨基酸、芳香化合物和胺类化合物，数量分别为3种、2种、1种和1种。需要注意的是，对主成分分离影响最大的是胺类和氨基酸类碳源。

表2 方差分解主成分提取分析

表3 不同碳源的主成分载荷因子

2.6 土壤养分与微生物多样性之间相关性

土壤微生物想要生存和繁殖，必须要依赖土壤中的养分，确切地说，要依赖有机碳和氮源。所以，土壤养分对微生物群落多样性具有至关重要的作用(表4)，土壤微生物群落功能的变化与土壤养分的变化呈正比例关系。与土壤pH之间的关系为负相关。土壤微生物群落优势度指数不容易受到土壤养分的影响，这是因为，碳源利用丰富度指数(S)、均匀度指数(E)和物种丰富度指数(H)土壤养分各指标的相关系数，均高于优势度指数(Ds)。概而言之，土壤养分、土壤pH和微生物群落功能多样性之间，是相互依赖和影响的，土壤养分的贡献程度较高，土壤pH的贡献程度较低。由以上推断可知，滨海湿地不同植物群落土壤微生物群落多样性会存在较大差异。

表4 土壤养分与微生物多样性之间相关性

注：*，**分别表示在0.05，0.01水平上差异显著。

3 讨论与结论

土壤微生物利用碳源的程度显示了其活性，这种利用水平为平均颜色变化率(AWCD)，侧面反映了微生物种群数量及其活动规律、分布特征等。其中AWCD值越大，说明微生物群的密度较大，具有较强的活性，而如果AWCD值越小，则说明微生物群的密度较小，不具备较强的活性。人们在研究中发现，在不同的植物群落的土壤中培养微生物，其活性存在较大的差异性，尤其是从Biolog-ECO板中碳源代谢能力角度来讲，红树林湿地和芦苇湿地中的微生物代谢能力更为强大，探究其深层次的原因，与碳源物质密不可分。在红树林湿地和芦苇湿地中，由于土壤中的养分含量高，那些与碳源物质能够融洽并存的微生物能能够充分利用板中的碳源，提高碳源代谢能力，产生更多可利用碳源，从而有利于更多的微生物滋生。相关研究还发现了另一个现象，即微生物活性能够影响植被属性，这也收到了以往研究者的证实。红树林湿地和芦苇湿地中存在数量巨大的根系分泌物或植物残体，提高了土壤中的有机质含量，能够给予微生物更多的养分，从而提高其生物，促进微生物的生长发育与滋生，增加了新陈代谢的效率[21-22]。而在碱蓬滩湿地和互花米草湿地中，土壤中的含水量较低，养分不多，仅能满足植物生长所需，对于微生物获取养分造成了一定的阻碍，从而使微生物减少了参与有机质分解活动，缺乏代谢活性，影响其生长发育及繁殖；红树林湿地和芦苇湿地具有天然优良的自然环境，能够提供充沛的养分，不仅能使植物旺盛生长，也能给微生物创造良好的生长环境，从而使得湿地中微生物的活性较为显著。研究人员还发现，微生物对不同碳源的利用也存在一些差异，对碳源利用水平最低的微生物位于湖滨高滩地，而对碳源利用水平最高的微生物位于沉水区，总体而言，微生物利用效果较好的碳源为羧酸类、碳水化合物碳源，而利利用效果较差的为胺类碳源。

土壤微生物对不同的碳源利用效果不同，呈现出不同的利用水平，大多是从多样性指数和丰富度方面体现的；而Shannon指数能体现微生物的功能多样性指数，即在颜色变化率相同的条件下，土壤微生物利用碳源的种类和数量，该指数不仅能反映微生物物种的变化度，还能体现其差异度。当微生物利用碳源种类和数量较少时，该指数呈现较低的状态[23-25]。另外，研究物种时，还要考虑其分布均匀程度，一般采用Mc-Intosh指数进行衡量，即单位面积内分布的物种数量越多，则该指数越大。而Shannon指数除了能够反映微生物群落分布的均匀度，还能反应物种数量。研究人员发现，微生物群落在红树林湿地和芦苇湿地的Shannon-Wiener指数较高，说明该区域的微生物分布比较均匀，且种类繁多，是较为适宜微生物群落生长的区域。

分析碳源利用的主成分分析发现，不同的土壤微生物在代谢功能多样性等方面存在较大差异，而差异表现最明显的是聚合物类和羧酸类，主要原因在于其成分具有与根系分泌物相似的成分，由此表明，该类分泌物极大地影响了微生物的群落功能[26-28]，主要表现在分泌物不断积累，不仅会影响植株正常的生长发育，还会影响微生物的活动。微生物在生长发育过程中所需要的碳源和氮源，能够从土壤养分中获得，本研究所探究和分析的问题是土壤养分与微生物多样性之间存在的关系(表4)。此外，本研究发现，微生物所需的养分主要来源自土壤养分，其多样性受到土壤养分的影响为正向的，而受到土壤pH的影响为负向的，土壤有效养分与微生物多样性呈现正相关关系。整体而言，土壤养分和土壤pH是微生物多样性的显著指标之一，影响了微生物群落的分布；微生物群落分布还受到植物种类、土壤属性和植被覆盖度等因素的影响，对这些因素的研究有助于土壤肥力的保持。