三例美洲驼狂犬病自然病例的诊断

曹 霞 郑秉武 丁玉林 甘 迪 刘淑英 王金玲*

(1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特，010018；2.农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特，010018；3.呼和浩特市园林管理局动物园管理处，呼和浩特，010050)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒引起的一种以致死性脑炎为特征的人畜共患性传染病[1]。狂犬病广泛流行于世界各地，据世界卫生组织(WHO)统计报道全球每年有6万多人和数百万的动物死于狂犬病，我国每年因狂犬病死亡的人和动物数量仅次于印度居世界第二[2]。近些年，内蒙古自治区不同动物源狂犬病一直发生，2009—2012年从内蒙古地区分离到19株不同动物源狂犬病病毒[3-5]。狂犬病一直在威胁着动物和人类的生命安全。2015年底，内蒙古自治区某动物园3只美洲驼相继出现神经症状并陆续死亡，作者采用多种方法确诊为狂犬病。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3只病死成年美洲驼(Lamaglama)，病例号分别11465、11478和11487，由内蒙古自治区某野生动物园提供。

1.2 临床症状观察和尸体剖检

通过询问动物园兽医和现场观察，记录发病美洲驼的临床症状。对病死美洲驼全面尸检，观察和记录大体病变。剖检过程中分别取大脑、小脑、延脑、脑干、海马和脊髓等全身各组织器官，大小为1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，立即放入10%中性福尔马林溶液中固定。

1.3 病理组织切片制备和观察

组织固定24 h后进行修块、脱水和透明，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，苏木素-伊红染色(HE)，制备病理组织切片和进行病理组织学观察。

1.4 狂犬病病毒特异性抗原检查

1.4.1 直接免疫荧光试验(DFA)

在生物安全柜内，用无菌镊子分别取少量3只美洲驼新鲜小脑组织放在清洁载玻片上，用镊子捻成糊状并均匀涂在载玻片上，再用无菌吸纸粘去多余的脑组织，使载玻片上形成薄层半透明的脑组织膜，将载玻片放入4 ℃预冷的丙酮内10 min，取出后自然干燥，用荧光标记的狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体(CHEMICON，rabies DFA reagent)滴到载玻片脑组织上，室温孵育30 min，PBS 漂洗3 次，1 min/次，最后50%甘油封片。荧光显微镜观察，若脑组织内出现亮绿色的荧光信号判为阳性。同时以健康脑组织为阴性对照。

1.4.2 免疫组织化学

4 μm厚度的美洲驼脑组织石蜡切片在40 ℃和50 ℃分别烤片3 h，梯度酒精脱蜡与水化，切片放入沸腾的0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中反应15 min进行抗原修复，自然冷却后放入TBS-T液摇洗3次，3 min/次。在组织上滴加适量的3%H2O2，湿盒中室温静置30 min，封闭内源性过氧化物酶，TBS-T液中摇洗3次，3 min/次。加适量的封闭山羊血清工作液于组织上，37 ℃湿盒内静置30 min。倾去血清，勿洗，并将组织周围的残留血清擦干。在组织上添加适量的狂犬病病毒ERA株弱毒疫苗免疫小鼠获得的多克隆抗体(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供)，4 ℃过夜，再放入37 ℃温箱复温30 min，倾倒多抗后用TBS-T液摇洗3次，3 min/次。二抗37 ℃静置15 min，再放入TBS-T液中摇洗3次，3 min/次。滴加辣根标记液，37 ℃10 min，TBS-T液摇洗3次，3 min/次。DAB显色5—20 min，放入苏木素复染5 min和自来水冲洗。最后脱水、透明和中性树胶封片。空白对照组用PBS液代替多抗。

2 结果

2.1 临床症状

2015年11月3日，1只成年雄性美洲驼(11465)突然出现神经症状，狂躁不安，乱跑，撕咬同群其他美洲驼，爬跨动作频繁，后期四肢麻痹，卧地不起，于11月4日9：00死亡，病程2 d。2015年12月8日，1只于2015年11月3日被咬伤肩部和四肢的成年雌性怀孕美洲驼(11478)突然发病，症状与11465号美洲驼相似，于12月9日死亡，病程2 d，疾病潜伏期34 d。2015年12月20日又1只于2015年11月3日成年雌性怀孕美洲驼(11487)突然四肢瘫痪，卧地不起，食欲废绝，轻度流涎，对外界刺激较敏感，无狂暴的神经症状，体温38.4 ℃，于2015年12月26日死亡，病程7 d，疾病潜伏期41 d。

2.2 大体病变

3只美洲驼尸体均明显角弓反张，全身各组织器官严重的淤血；心衰明显，心脏横径明显增宽，心肌质软；肝肿大，呈土黄色，质软易碎；脑脊液增多，脑轻度水肿。其他组织无明显病变。

2.3 病理组织学变化

3只美洲驼主要病变相似，在小脑多数浦金野细胞(图1)、大脑多形细胞、海马多形细胞、脑干神经细胞(图2)和脊髓多极运动神经元胞浆内均可见大小不等的均质红染的圆形、椭圆形的狂犬病病毒包涵体，脑小血管周围出血灶多见。11487号美洲驼脑组织典型的非化脓性脑炎，脑组织部分小血管周围有明显的淋巴细胞“管套”。多数心肌细胞轻度至中度的细胞肿胀。其他组织出现程度不同的淤血和水肿。

图1 美洲驼小脑浦金野细胞浆内圆形的嗜酸性狂犬病病毒包涵体(HE×400)Fig.1 Eosinophilic Negri body within the cytoplasm of the cerebellum Purkinje’s cells(HE×400)

2.4 狂犬病病毒特异性抗原检查结果

2.4.1 DFA结果

在阴性对照成立的情况下，在3只病死美洲驼小脑组织内检测到典型的亮绿色的狂犬病病毒抗原的特异性阳性信号(图3)。

图2 美洲驼脑干神经细胞浆内圆形均质的嗜酸性狂犬病病毒包涵体(HE×400)Fig.2 Eosinophilic Negri body within the cytoplasm of the neurocyte in the brain stem(HE×400)

图3 美洲驼小脑组织大量大小不等的亮绿色的特异性狂犬病病毒抗原阳性信号(DFA×400)Fig.3 A number of bright green，positive signals of rabies virus antigen in the cerebellum tissues of llama(DFA×400)

2.4.2 免疫组织化学结果

在3只病死美洲驼的小脑浦金野细胞的胞浆内检测到大小不等的圆形、椭圆形的典型的棕色狂犬病病毒抗原的特异性阳性信号(图4)。

图4 美洲驼小脑浦金细胞浆内圆形和椭圆形的棕色狂犬病病毒抗原阳性信号(IHC，标尺=10 μm)Fig.4 The round，oval brown signals of rabies antigen in the cytoplasm of cerebellum Purkinje’s cell of llama(IHC，Bar=10 μm)

3 讨论

狂犬病病毒可以感染包括人类在内的所有温血动物，并引起致死性病毒性脑炎[6]。关于美洲驼狂犬病的自然病例罕有报道，自从1990年美国俄克拉荷马州疾病控制中心首次报道了美洲驼狂犬病[7]至今，世界上还未再有美洲驼狂犬病的报道。狂犬病具有证病意义的病理变化是在脑神经细胞浆中观察到大小不等的嗜酸性病毒包涵体[8-9]。在本研究中诊断的3例病死美洲驼的小脑浦金野细胞、脑干多极神经元、大脑多形细胞和海马多形细胞胞浆内均观察到典型的大小不等的嗜酸性的狂犬病病毒包涵体。狂犬病的诊断方法还可通过DFA和免疫组织化学方法，DFA方法也是WHO公认的狂犬病的确诊方法[6]。本研究通过DFA方法在小脑组织内均检测狂犬病病毒抗原亮绿色的特异性阳性信号[3]。同时又通过免疫组织化学方法在小脑浦金野细胞胞浆内均检测到典型的大小不等的棕色特异性狂犬病病毒抗原阳性信号[8]。

组织病理学上，不是所有狂犬病动物都会表现典型的病毒性脑炎[4]。本研究诊断的3只美洲驼中，仅11487号美洲驼脑组织表现出以淋巴细胞性“管套”为主要病变的病毒性脑炎。从病程分析，11465号和11478号美洲驼的病程均为2 d，病程短，机体损伤与抗损伤斗争时间短，淋巴细胞还未来得及渗出或渗出少，炎症变化表现不明显；而11487号美洲驼病程为7 d，病程长，机体损伤与抗损伤斗争时间长，炎性细胞渗出多，脑炎病变明显。

人和动物狂犬病绝大多数都是由犬咬伤引起[6]。据调查，发病的动物园内流浪犬可自由进入，特别是夜晚，因此，可以推测最初发病的11465号美洲驼与狂犬病带毒犬的咬伤相关。针对狂犬病的防控主要两个方面，一方面是进行狂犬病疫苗免疫，另一方面是切断与带毒犬的接触。目前，我国还没有针对家畜和野生动物狂犬病的专用疫苗，有条件的动物园可以用犬狂犬病疫苗进行暴露前后的疫苗免疫，并建议定期免疫。同时，采取措施严格控制流浪犬入园，杜绝与流浪犬的接触。