攀枝花市山羊消化道蠕虫调查及分析

唐天才，刘城成，塔 英，林宝山，陈天祥，曾晓旭，吴毅鹏，宋定州，郝力力*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.阿坝州动物疫病预防控制中心，四川 马尔康 624000；3.四川省若尔盖县科学技术和农业畜牧局，四川 阿坝州 624500；4.攀枝花市农林科学研究院，四川 攀枝花 617061)

【研究意义】寄生虫病是危害山羊健康的一大类疫病，其中消化道蠕虫感染的种类最多包括线虫、吸虫和绦虫等，且经常表现为混合感染[1]。若未对放牧的山羊驱虫，可能会导致山羊蠕虫感染率高以及感染强度大，从而影响山羊的生长发育、生产性能，甚至诱发其他疾病，严重者可导致死亡，给山羊养殖带来重大的经济损失。【前人研究进展】近年来，先后有学者对国内部分地区的山羊消化道蠕虫感染情况进行了系列调查，结果显示各地区有着不同的感染程度、感染虫种以及优势虫种[1-2]。如陈静[2]对重庆山羊肠道寄生虫调查，检出5种蠕虫，总感染率为98.67 %，以圆线虫为优势虫种；肖芳萍[1]对贵阳山羊消化道寄生虫调查，检出13种蠕虫，总感染率为100 %。【本研究切入点】近年来，随着攀枝花养羊业的不断发展，羊存栏数从2005年的467 430只增加到2010年568 460只，再到2016年702 320只，年均增长率约4 %。随着攀枝花市山羊一级传染病预防工作的深入开展，山羊的烈性传染病已得到一定程度的控制，而寄生虫的危害却日益突出；交易的频繁，流通领域的扩大，同时也导致了山羊寄生虫病的扩散。自1987年以后就未见系统开展攀枝花山羊寄生虫病研究的报道。【拟解决的关键问题】因此，迫切需要对山羊消化道寄生蠕虫的种类开展调查，以期初步明确种类，为今后该地区山羊消化道蠕虫病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 虫体采集 于2017年12月至2018年12月屠宰攀枝花仁和区、盐边县以及米易县的瘦弱山羊或有临床症状的山羊，然后采用蠕虫学完全剖检法检查：胃、胆囊、十二指肠、盲肠、回肠、空肠、胰腺以及食管，内容物用生理盐水冲洗，再挑出虫体并置于75 %酒精溶液中，带回实验室保存待检(由攀枝花农科院协助完成)。

1.1.2 主要器材 电泳仪电源(北京六一仪器厂，DYY-6C型)、台式高速离心机(eppendorf 5402型)、Leica S9D体视显微镜及Bio-Rad梯度PCR扩增仪(PTC240型)等。

1.1.3 主要试剂 组织基因组DNA提取试剂盒(EasyPure Genomic DNA Kit)，Trans 2K Plus DNA maker，2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)，1×TAE溶液，引物合成、测序均由生工生物工程技术服务有限公司(成都公司)完成。

1.2 试验方法

1.2.1 虫体形态观察 根据《中国畜禽寄生虫形态分类图谱》[3]及《中国草食家畜常见寄生蠕虫图鉴》[4]，在体式显微镜下观察虫体形态，测量虫体的大小以及长度，并拍照。

1.2.2 分子生物学鉴定 DNA提取：取形态初步鉴定后的虫体，放于1.5 mL的EP管，用ddH2O冲洗2～3次，剪虫体部分置于新的EP管，再按照组织基因组DNA提取试剂盒的步骤逐步提取，置于-20 ℃保存备用。

PCR扩增：线虫和吸虫的分子鉴定分别采用Morise[5]和Van[6]报道的方法，其中线虫COI基因引物为：COIjb3-F:5′-GATTTTTTGGTCAYCCGCARG T-3′；COIjb5-R:5′-GYAACTACATAATAAGTRTCRT G-3′，400 bp。扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸25 s，40个循环；72 ℃延伸8 min。吸虫18SrRNA基因引物为：18S9 modF: 5′-GATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTG-3′；18S637modR:5′-TACGCTWYTGGAGCTGGAGTTACCG-3′，610 bp。扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，40个循环；72 ℃延伸8 min。2种反应均采用25 μl的体系：2×EasyTagPCR SuperMix 12.5 μl、上下游引物各1 μl(10 μmol·L-1)、模板1 μl、ddH2O 9.5 μl混匀，并设阴性对照(去离子水)。取2 μl PCR扩增产物于1.2 %琼脂糖凝胶中100V电泳30 min，凝胶成像仪中观察结果。

序列比较分析与进化树构建：PCR产物送生工测序，所得序列用DNA Star软件进行拼接，在NCBI中blast进行比对，最后应用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1000)构建进化树。

2 结果与分析

2.1 山羊消化道蠕虫形态鉴定以及混合感染情况

本调查分6次剖检，共剖24只山羊，从形态特征以及采集部位初步鉴定攀枝花山羊消化道蠕虫有6种，其中线虫5种，分别是羊仰口线虫(Bunostomumtrigonocephalum，图1-A)，长19.51～21.90 mm，采自空肠与回肠；粗纹食道口线虫(Oesophagostomumasperum，图1-B)，长21.10～23 mm，采自回肠、盲肠以及结肠；捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus，图1-C)，长21.00～24.12 mm，采自真胃与小肠；羊毛尾线虫(Trichurisovis，图1-D)，长50.50～80.00 mm，采自盲肠；绵羊夏伯特线虫(Chabertiaovina，图1-E)，长11.20～12.50 mm，采自结肠。1种吸虫为胰阔盘吸虫(Eurytremapancreaticum，图1-F)，大小为6.7～7.5 mm×2.8～3.6 mm，采自胰腺。混合感染统计显示：攀枝花山羊消化道蠕虫混合感染情况严重，混合感染种类多达5种，2种混合感染主要为胰阔盘吸虫与不同线虫的混合感染，3种以上混合感染主要为胰阔盘吸虫和不同线虫之间的混合感染(表1)。

2.2 PCR扩增结果

以提取DNA为模板，分别扩增线虫和吸虫的目的基因，如图2所示，在400 和610 bp处均出现特性条带，大小与预期相符。

2.3 序列分析

所有序列经拼接，两两比对，共得8条，其中捻转血矛线虫的序列3条，其余虫种的序列均为1条。

表1 山羊消化道蠕虫混合感染情况Table 1 Polyinfection infection of digestive tract worms in goats

A：羊仰口线虫；B：粗纹食道口线虫；C：捻转血矛线虫；D：羊毛尾线虫；E：绵羊夏伯特线虫；F：胰阔盘吸虫A：Bunostomum trigonocephalum；B：Oesophagostomuma sperum；C：Haemonchus contortus；D：Trichuris ovis；E：Chabertia ovina；F：Eurytrema pancreaticum图1 山羊消化道蠕虫的形态Fig.1 Morphology of worms found in digestive system of goats

线虫序列BLAST比对后选取同源性最高的序列作为参考序列，构建进化树。如图3所示，各线虫均聚于各自种类的大支。羊仰口线虫与云南(JX272232)、吉林(JX272211)、山西(JX27223)分离的羊仰口线虫(Bunostomumtrigonocephalum)的同源性达99.46 %～99.73 %。绵羊夏伯特线虫与分离自陕西的绵羊夏伯特线虫(Chabertiaovina. KF279336)同源性最高，达99.46 %。羊毛尾线虫与分离自湖南的羊毛尾线虫(Trichurisovis. KY656514)同源性最高，达100 %。粗纹食道口线虫与分离自湖南的粗纹食道口线虫(Oesophagostomumasperum. KM200767)同源性最高，达99.73 %。捻转血矛线虫与美国的捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus. AF004935)同源性最高，为93.50 %～94.04 %。吸虫序列BLAST比对后选取同源性最高的序列以及相近吸虫的18SrRNA基因序列等作为参考序列，构建进化树。结果显示本次所得的胰阔盘吸虫与甘肃的胰阔盘吸虫(Eurytremapancreaticum. DQ401034)同源性最高，达99.00 %(图4)。

3 讨 论

长期以来，形态学鉴定方法是寄生虫鉴定的基础，但此法要求工作人员需要丰富的经验，且对于形态相近以及未正确保存的虫体较难准确鉴定。随着分子生物学的发展，产生的DNA条形码(DNA barcoding)技术用于物种鉴定具有非常明显的优势，18SrRNA和COI基因作为DNA条形码基因之一，已被广泛的运用于吸虫、线虫、绦虫等蠕虫的鉴定[7-9]。因此，本研究采用形态学与分子生物学相结合的方法对山羊消化道蠕虫的种类进行了鉴定。

M：DL 2000 plus marker；1～5：线虫样本；6：吸虫样本；7：阴性对照M：DL 2000 plus marker；1-5：Nematodes samples；6：Trematoda samples；7：Negative control图2 线虫COI基因和吸虫18SrRNA基因的PCR反应后电泳图Fig.2 PCR products of COI gene of nemtodes and 18SrRNA gene of trematodes

本研究应用PCR对攀枝花山羊线虫的COI基因序列和吸虫的18SrRNA基因序列进行了分析，值得注意的是，捻转血矛线虫各分离株的COI序列差异较大在2.4 %～5.1 %之间，与Genbank中其他捻转血矛线地理株的差异在5.96 %以上。国内刘俊琦[10]对永州市羊捻转血矛线虫的COI基因进行了分析，其虫株之间的差异在2.0 %～2.9 %，与Genbank其他捻转血矛线虫差异在15 %以上；白鹏霞[11]对甘南藏族自治州牦牛的捻转血矛线虫COI基因进行了分析，结果表明该株与其他捻转血矛线虫地理株的同源性在92.5 %～97.4 %之间；国外Tanveer将巴基斯坦的血矛线虫与11国家的血矛线虫分离株进行了COI序列的比较与分析，表明血矛线虫的COI基因流动率很高[12]，据此推测捻转血矛线虫的COI基因具有种群遗传多样性。另外，本研究也将捻转血矛线虫的COI序列翻译为蛋白的氨基酸序列进行了比对与分析，结果显示血矛属线虫COI序列编码的蛋白序列完全相同，从氨基酸序列只能鉴定到属，而不能鉴定到种，与白鹏霞的研究结果一致[11]。

关于不同地区羊消化道蠕虫种类和分布，国内进行了相关调查，结果表明诸多因素如地区、品种、饲养方式等均会一定程度的影响消化道蠕虫种类。如黄占欣(2012)等[13]对邯郸地区羊消化道蠕虫感染情况进行了调查，检出11种蠕虫，结果表明集约化养殖与放牧散养羊群消化道蠕虫的感染种类差异显著。袁炜(2014)[14]对湖北省公安县放牧山羊蠕虫病开展了调查，检出10种消化道蠕虫，表明线虫一年四季感染情况均严重。本次对攀枝花山羊消化道蠕虫种类进行了初步调查，结果显示山羊消化道感染5种线虫和1种吸虫，且存在混合感染，混合感染种类在2～5种之间，其中以混合感染2和3种蠕虫所占的比例最大(表1)，与国内研究报道基本一致[2,13-14]，表明我国山羊消化道蠕虫普遍存在混合感染。在四川省，甘孜州和阿坝州放牧牦牛和藏绵羊的肝片吸虫感染率普遍偏高，然而本次调查却未检出肝片吸虫，只检出胰阔盘吸虫，这可能与两种吸虫的生活史以及山羊的放牧地点有关。肝片吸虫的中间宿主为椎实螺(淡水螺的一种)，而胰阔盘吸虫的中间宿主为陆地螺和中华草螽。本研究中所剖山羊均来自于农户，放牧地点远离河流、沼泽等潮湿的环境，山羊与胰阔盘吸虫中间宿主—陆地螺接触的机会多，这可能是胰阔盘吸虫感染严重的主要原因之一，后期可进一步开展陆地螺和中华草螽感染胰阔盘吸虫的调查。

图3 基于线粒体COI基因的线虫的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on the COI gene of nematode

图4 基于核糖体18SrRNA基因的胰阔盘吸虫及其相关吸虫的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on the 18SrRNA gene of E.pancreaticum and other related species of trematode

攀枝花属南亚热带亚湿润气候，年平均气温在19～23 ℃之间，全年无冬，四季不分明，这样的气候条件对蠕虫的繁殖非常有利。因此，后期需要提高农户的驱虫意识，加强山羊蠕虫病的监测，开展山羊消化道原虫和体表寄生虫种类的全面调查，从而为该地区制定合理的驱虫方案提供依据。

4 结 论

基于样本采集部位、形态特征以及分子生物学方法，鉴定出攀枝花山羊消化道感染蠕虫种类多，包括粗纹食道口线虫、羊仰口线虫、捻转血矛线虫、羊毛尾线虫、绵羊夏伯特线虫以及胰阔盘吸虫。混合感染严重，需进一步加强山羊寄生虫病的监测及防控。