水稻C24-甾醇甲基转移酶基因OsSMT2的生物信息学分析

黄小龙，翟立升，闫慧清

(1. 贵州师范大学 贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵州 贵阳 550001；2. 贵州师范大学 国家林业局西南喀斯特山地生物多样性保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；3. 贵州师范大学 生命科学学院, 贵州 贵阳 550001)

【研究意义】植物甾醇在自然界中广泛存在，是以环戊烃全氢菲为骨架的三萜类化合物，有游离态和结合态2种形式，主要分布在植物的根、茎、叶、果实和种子中[1]。植物甾醇在食品、医学和动物中的研究表明，其具有抑制肿瘤、降低血液胆固醇、抗菌消炎、调剂免疫和抗衰老的作用，应用前景十分广阔[2-6]。植物甾醇与动物甾醇的区别是C-24位置多了额外的烷基，这个过程由甾醇甲基转移酶(SMTs)完成[7]，SMTs是植物甾醇代谢途径中的关键限速酶[8]，但其在水稻中的功能还有待更深入的研究。【前人研究进展】到目前为止，植物中大量的SMT基因被分离克隆，如菠菜[9]、大豆[10]和拟南芥[11]等。有研究表明，SMT基因在植物响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用[12]。在高盐胁迫下，大豆中总甾醇含量较未胁迫的降低50 %，谷甾醇含量没有变化，但是饱和脂肪酸的含量大量增加，说明在植物中甾醇含量的稳定对于抵抗高盐胁迫引起的伤害有重要作用[13]。在植物中乙基甾醇有利于增强细胞膜的内聚力，在面对高温和低温胁迫时，植物体内的甲基甾醇大量转化成乙基甾醇，从而调节植物体的温度变化以适应高温和低温胁迫[14]。植物甾醇除了响应非生物胁迫外，还响应细菌性病原体引起的生物胁迫，在拟南芥中沉默鲨烯合酶、甾醇甲基转移酶2、C-22甾醇去饱和酶基因，加强拟南芥细胞中营养物质的外排，促进细菌性病原体的生长；在拟南芥超表达C-22甾醇去饱和酶基因的植株中营养物质的外排受到抑制，表明拟南芥通过调控甾醇含量的变化控制细胞中营养物质的外排，响应细菌引起的免疫应答[15]。【本研究切入点】甾醇甲基转移酶在植物中的作用十分重要，干扰OsSMT1的表达使得水稻具有矮化和抗旱的表型[16]，OsSMT2已经被克隆，但目前研究仅知道其参与了植物甾醇的生物合成[7]，并不清楚其分子作用机制。【拟解决的关键问题】因此，拟通过生物信息学分析的方法研究水稻OsSMT2基因的结构、功能和表达模式，为该基因的进一步研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

检索OsSMT2的相关文献资料，以OsSMT2在RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据库中的MSU Locus号(LOC_Os03g04340)为线索，下载该基因的相关序列进行分析。

1.2 方法

1.2.1 水稻OsSMT2基因的序列比对分析 通过RGAP数据库下载OsSMT2基因的基因组序列、CDS序列和氨基酸序列，利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blast工具，将水稻OsSMT2基因的氨基酸序列与GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库进行比对，选取水稻(Oryzasativa)、药用野生稻(Oryzabrachyantha)、粟(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、节节麦(Aegilopstauschii)、大麦(Hordeumvulgare)、凤梨(Ananascomosus)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminata)等10种不同植物的SMT2蛋白进行序列比对分析，寻找STM2蛋白的保守结构域。选取多个物种的SMT2氨基酸序列，利用MEGA-X软件进行同源性分析，并通过邻接法构建进化树。

1.2.2 水稻OsSMT2蛋白的性质和结构分析 通过Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)所提供的蛋白质序列分析工具，对OsSMT2蛋白质的理化性质(分子量、理论pI、正负电荷残基总数及半衰期等)进行预测与分析。利用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)预测OsSMT2蛋白质的疏水性/亲水性，SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测OsSMT2蛋白质的信号肽，TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测OsSMT2蛋白质的跨膜结构域，NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点。通过SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)工具 (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析OsSMT2蛋白质结构域，利用在线网站GOR4 (https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)对OsSMT2蛋白质的二级结构进行预测，利用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)同源建模网站预测OsSMT2蛋白质的三级结构。

1.2.3 水稻OsSMT2基因顺式调控元件的分析 在水稻RAP-DB数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中，获取水稻OsSMT2基因起始密码子上游2kb区域的核苷酸序列作为OsSMT2基因的启动子区域，利用PlantCARE植物顺式调控元件分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，对OsSMT2基因的启动子进行分析。

1.2.4 水稻OsSMT2基因共表达基因的GO 富集和KEGG富集分析 通过RED数据库(http://expression.ic4r.org/co-search)中的共表达工具，设置PCC(Pearson correlation coefficient)为0.7，获得OsSMT2基因的共表达基因。然后通过David网站(https://david.ncifcrf.gov/)和Kobas网站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)对这些基因进行GO富集和KEGG富集分析。

1.2.5 水稻OsSMT2基因的表达模式分析 通过CREP数据库(http://crep.ncpgr.cn/)下载水稻OsSMT2基因在Minghui 63中的芯片数据，研究OsSMT2基因在水稻不同组织中的表达模式。

2 结果与分析

2.1 水稻OsSMT2蛋白的性质

水稻OsSMT2基因的基因组序列全长为1875 bp，无内含子，CDS全长1092 bp，编码363个氨基酸。OsSMT2蛋白质分子量40 618.61，理论pI为8.19，负电荷残基总数(Asp+Glu)为41，正电荷残基总数(Arg+Lys)为43，分子式C1822H2828N508O514S17，总原子数5689，脂肪酸指数为82.20，预计半衰期为30 h，不稳定指数(Ⅱ)为28.51，该蛋白为不稳定蛋白。OsSMT2蛋白的亲水性水平平均为-0.176，是亲水性蛋白(图1A)。信号肽S值在1～32位氨基酸之间，其中最大值在第26个氨基酸；预测值是0.797，平均分值为0.371(小于阈值0.5)，说明该蛋白不含有信号肽(图1B)。该蛋白在第6和第24个氨基酸之间存在1个跨膜结构域(图1C)。磷酸化位点有31个，包括Ser16个、Thr8个和Tyr7个(图1D)。

A.OsSMT2蛋白的亲水性分析; B.OsSMT2蛋白的信号肽分析; C.OsSMT2蛋白的跨膜结构域预测; D.OsSMT2蛋白的磷酸化位点分析A.Hydrophilic analysis of OsSMT2; B.Signal peptide analysis of OsSMT2; C.Transmembrane domain prediction of OsSMT2; D.Phosphorylation sites prediction of OsSMT2图1 OsSMT2蛋白的性质分析 Fig.1 Analysis of the properties of OsSMT2

h为α螺旋，e为延伸链，c为无规则卷曲h: Alpha helix; e: Extended strand; c: Random coil图2 OsSMT2蛋白的二级结构预测Fig.2 Secondary structure prediction of OsSMT2

图3 水稻OsSMT2(A)和砷(III)S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶(B)蛋白的三级结构Fig.3 Tertiary structure of OsSMT2 (A) and As(III) S-adenosylmethionine methyltransferase (B)

2.2 水稻OsSMT2蛋白的结构

2.2.1 二级结构 预测结果显示，OsSMT2蛋白有3种二级结构，其中α螺旋有132个氨基酸残基参与，占36.36 %；延伸链有76个氨基酸残基参与，占20.94 %；无规则卷曲有155个氨基酸残基参与，占42.70 %(图2)。

2.2.2 三级结构 从图3看出，水稻OsSMT2蛋白质的三级结构以无规则卷曲为主。

图4 不同物种中OsSMT2的同源蛋白比对Fig.4 Homologous alignment of OsSMT2 in different species

图5 不同物种中SMT2蛋白的保守结构域Fig.5 Conserved domains of SMT2 in different species

图6 OsSMT2基因的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of OsSMT2

图7 OsSMT2在水稻Minghui 63 中的芯片表达数据Fig.7 Genechip expression data of OsSMT2 in Minghui 63

2.3 水稻OsSMT2蛋白的同源性

OsSMT2蛋白具有甲基转移酶结构域，位于OsSMT2蛋白质第107～283位氨基酸，还含有甾醇甲基转移酶C末端结构域，位于OsSMT2蛋白质的第295～360位氨基酸(图4)。通过MEME网站预测这些蛋白的保守基序发现，共有10个保守基序，其中Motif 1～9在10个物种中都含有，可见这9个基序为SMT2蛋白的核心基序(图5)。

2.4 OsSMT2基因的系统发育树和表达谱

从图6看出，水稻中OsSMT2与药用野生稻的ObSMT2亲缘关系最近，与小米、高粱、玉米、大麦等主要粮食作物中SMT2的亲缘关系较近。水稻OsSMT2基因在吸水后72 h种子中的表达量最高，在胚根、胚芽和小花中表达量相对较高，在叶中表达量最低(图7)。表明，OsSMT2基因在水稻生长起始阶段有重要的功能。

2.5 水稻OsSMT2基因启动子元件

在水稻OsSMT2基因启动子区域，除存在RNA聚合酶结合位点TATA-box、CAAT-box等基本调控元件外，还存在胁迫诱导元件、激素响应元件和光诱导元件(表1)。从OsSMT2基因启动子区域具有的顺式作用元件种类和数量推测，OsSMT2基因的表达模式受光和激素的诱导。启动子中还存在4种胁迫响应元件，表明，OsSMT2基因可能与植物的胁迫响应有关。

2.6 OsSMT2基因共表达基因的GO富集和KEGG富集

共表达基因GO主要富集在微管、微管运动活性、基于微管的运动、驱动蛋白复合物、ATP结合、ATP酶活性、染色质结合、有丝分裂染色体浓缩、胞质分裂、微管细胞骨架组织中(图8A)。KEGG富集9个代谢通路，包括DNA复制、泛素介导的蛋白水解、类固醇生物合成、吞噬、嘧啶代谢、内吞作用、嘌呤代谢、次生代谢产物的生物合成和代谢途径等代谢通路中(图8B)。

表1 OsSMT2的启动子元件Table 1 Promoter elements of OsSMT2

横坐标表示富集到的基因数，A为 GO富集，B为 KEGG富集The abscissa indicates the number of genes enriched, A, GO enrichment, B, KEGG enrichment图8 水稻OsSMT2基因共表达基因的富集Fig.8 Enrichment of co-expressed genes of OsSMT2

3 讨 论

3.1 OsSMT2基因的功能相对保守

蛋白质的二级结构一般包含α螺旋、β转角、延伸链和无规则卷曲，相邻氨基酸残基在氢键的作用下形成不同的空间结构，使蛋白质具有不同的活性和功能。因此，蛋白质结构的预测对推测其功能具有重要参考价值。水稻OsSMT2基因的二级结构以无规则卷曲为主，有42.70 %的氨基酸残基参与。蛋白质的三级结构是在二级结构的基础上发生折叠，使蛋白质具有更复杂的生物活性，并且能够执行生物催化功能。对OsSMT2蛋白进行同源建模时发现，OsSMT2蛋白结构同样以无规则卷曲为主，表明水稻OsSMT2蛋白中132个氨基酸残基参与的α螺旋可能是起主要功能的区域。

水稻OsSMT2基因的功能结构域在不同物种中保守性较高，Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 9处在甲基转移酶结构域和甾醇甲基转移酶C末端结构域中，是2种结构域的核心基序，SMT2基因在不同植物中的核心保守基序相同。因此，不同植物中SMT2基因的功能十分相似，水稻OsSMT2基因的研究结果也可为其他物种提供参考。水稻OsSMT2基因在主要粮食作物中同玉米、小麦、高粱的亲缘关系最近，同大麦的亲缘关系最远，表明水稻OsSMT2基因的功能预测可以为玉米、小麦、高粱等粮食作物SMT2基因的研究提供参考。

3.2 OsSMT2基因参与水稻的抗寒和耐旱

在OsSMT2基因的启动子区域存在多种响应元件，包括激素响应元件、光响应元件和胁迫响应元件。这些元件很可能会影响OsSMT2基因的转录激活，从而影响水稻中甾醇的含量以应对不同的外界胁迫。在大豆中，当环境温度较低时，植物总甾醇的含量会降低，豆甾醇和β-谷甾醇的比值升高，当温度升高时，大豆中植物总甾醇的水平会升高，其中油菜甾醇所占的比例与温度变化成正相关，并且豆甾醇和β-谷甾醇的比例下降[17]。水稻OsSMT2基因的启动子区域存在LTR元件参与低温响应，因此低温条件可能会影响水稻中OsSMT2基因的表达，进而影响水稻中甾醇的含量以抵抗低温胁迫。同样，在水稻OsSMT2基因的启动子区域存在MBS元件，该元件可以参与干旱诱导，推测OsSMT2基因可能响应干旱胁迫，因为当植物遇到干旱胁迫时，植物甾醇的分子结构使得其能够调节细胞膜的流动性和通透性，这种细胞膜性质的改变就可以抑制植物叶片中水分的流失，使植物在干旱条件下也能够生存[18]。黄瓜在低氧胁迫下，甾醇合成途径的产物-油菜素内酯可以促进黄瓜中糖类由叶片向根部的转运，并提高黄瓜根部糖酵解代谢酶的活性[19]。水稻OsSMT2基因启动子区域存在GC-motif 和ARE两种厌氧诱导元件，因此OsSMT2基因可能会响应低氧胁迫。综上所述，推测OsSMT2基因可能响应水稻低温、干旱和低氧胁迫，可作为水稻抗寒和耐旱育种方面的候选基因。

3.3 OsSMT2基因影响水稻种子萌发

拟南芥AtSMT2-1基因在烟草中超表达后，与野生型相比，转基因烟草中24-甲基甾醇的含量降低，抑制了细胞分裂，影响生长发育[20]。水稻OsSMT2基因共表达基因的GO富集和KEGG富集分析显示，这些基因主要参与DNA的复制和细胞分裂的主要过程，如DNA复制的起始、DNA解旋酶的活性、细胞形态的发生等过程。OsSMT2基因表达模式分析显示该基因在水稻种子萌发时的表达量最高，因此推测水稻OsSMT2基因可能影响水稻萌发过程中的细胞分裂，进而影响水稻的种子萌发率。

4 结 论

通过对水稻OsSMT2基因的生物信息学分析发现，水稻OsSMT2基因具有甲基转移酶结构域和甾醇甲基转移酶C末端结构域，参与水稻中甾醇的生物合成。该基因的启动子区域含有低温和干旱胁迫响应元件，因此OsSMT2基因可能参与水稻的非生物胁迫响应。共表达基因的富集分析显示，该基因可能参与DNA复制和细胞分裂的主要过程。OsSMT2基因的表达模式分析表明，OsSMT2基因在吸水后72 h种子中的表达量最高，OsSMT2可能会影响水稻种子萌发和植物发育。研究结果为水稻的抗逆改良和种子萌发提供了理论参考和候选基因。