毛细管电泳色谱联用法(CECLIF)检测运动营养品中α2受体激动剂

郭 翔

(重庆人文科技学院,重庆 401524)

运动营养品是针对运动人群开发的一类补充蛋白质、维生素等营养元素的食品,在近些年开始越来越流行,其中以补充蛋白质类在运动营养品较多[1]。而蛋白质补充剂多数以人工饲养畜禽类的动物源性原料制成,然而此类畜禽在饲养过程中易受到β-受体激动剂滥用的影响[2-3],造成最终产品中此类受体激动剂的超标。因此我国加大了对明令禁止的15种β-受体激动剂非法使用的打击力度,然而具有促进动物生长、提高瘦肉率功效,而未被列入国家禁用药物名单的β-受体激动剂同系物或衍生物,如α2-受体激动剂(可乐定、赛庚啶、赛拉嗪、右美托咪啶、胍那苄等),此类受体激动剂在动物促生长方面也有明显的效果,可显著提高猪的瘦肉率,降低了脂肪比率和背膘厚[4-5]。然而我国针对α2-受体激动剂类药物发布相关标准不多[6-7],仍然缺乏对多种α2-受体激动剂类药物检测的方法标准。因此建立以含动物源性蛋白为基质的食品中α2-受体激动剂的检测方法十分必要,特别是对运动员这类特殊人群的运动营养品中受体激动剂的筛查检测,评价此类食品的安全具有重要意义。

目前国内外检测α2-受体激动剂的方法主要有毛细管电泳法(Capillary electrophoresis,CE)、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)、毛细管电泳-色谱联用法(Capillary Electrophoresis Chromatography-Excited Induced Fluorescence,CEC-LIF)等[8-12]。毛细管电泳法由于方法的局限性,检测灵敏度一般不高[13];而高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法虽然方法的灵敏度能达到,但是样品的前处理复杂,步骤繁琐,限制了其实际的使用范围[14-15];而CEC-LIF,兼具了高效液相色谱法和毛细管电泳法的双重分离机制,并结合运用了灵敏度与选择性极强的激光诱导荧光技术,检测的灵敏度可以达到纳克级别,可以检测多种微量的α2-受体激动剂[16-18]。CEC-LIF结合激光诱导荧光技术的研究国内外也有报道,Nguyen等[19]采用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱(4-fluoro-7-nitrobenzofurazan,NBD-F)荧光衍生结合毛细管区带电泳联用技术,快速灵敏地分离检测了食品中的精胺和组胺;雷霄云等[20]采用毛细管电色谱-激发诱导荧光检测动物性食品中多肽类抗生素,所建立方法的灵敏度能满足对多肽类兽药的残留检测要求;Sapan等[21]以NBD-F为柱前衍生试剂,结合HPLC-荧光检测(FD)分析了大鼠血浆中的氨基酸,检出限可达2.8～20 fmol。但是针对运动营养品这类基质较复杂的样品,前处理的过程、衍生条件的控制以及仪器参数的选择等都会对α2-受体激动剂的测定结果产生很大的影响。所以本实验在参考相关文献的基础上[19-23],优化相关实验条件,建立一种毛细管电泳-色谱联用测定运动营养品中α2-受体激动剂的方法,以满足我国市场上对此类检测的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

α2-受体激动剂标准品(赛拉嗪99.6%、右美托咪啶99.3%、胍那苄98.5%) 上海安谱公司产品;硼酸(分析纯) 中国化学试剂研究所;乙腈和乙醇(色谱纯) 上海国药集团化学试剂有限公司;衍生试剂NBD-F纯度97% 日本东京化成工业株式会社;样品 随机购买于超市的动物源性运动营养品。

Risep-610型毛细管电泳-色谱分析系统 赛默飞世尔公司;2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司;4100型激发诱导荧光检测器 中科院大连物化研究所;KQ-500数控超声波仪 昆山市超声波仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 实验称取2.00 g样品于20 mL离心管中,分别加入5 mL乙酸铅(20 mg/L)以及5 mL三氯乙酸(20 mg/L)进行超声(功率500 W,40 kHz)提取30 min,4000 r/min离心15 min后移取上清液;将上清液加入到Oasis HLB固相萃取柱,分别用6 mL甲醇和水依次活化后上样,首先弃去流出液,然后用6 mL水洗涤,弃去流出液,用6 mL甲醇洗脱,收集洗脱液并于40 ℃氮气吹干。残余样品用1.0 mL流动相溶解混匀,用0.22 μm有机滤膜过滤,再进行荧光衍生反应并毛细管电泳-色谱检测。

1.2.2 荧光衍生反应条件的优化 取浓度为5 μg/mL的赛拉嗪、右美托咪啶和胍那苄的α2-受体激动剂物质混合溶液200 μL,加入200 μL硼酸溶液(50 mmol/L)、200 μL乙醇后,再加入200 μL NBD-F溶液,避光进行衍生反应。分别研究衍生剂浓度、衍生反应pH、衍生反应时间以及衍生反应温度对衍生反应的影响,以3种目标物的平均回收率作为判定指标。激光诱导荧光检测器参数为分离电压:-10 kV、辅助压力:3.8 MPa、检测波长:λex/λem=473 nm/530 nm。

1.2.2.1 衍生剂浓度的选择 在对3种α2-受体激动剂进行衍生反应时,需要加入适量的NBD-F来保证目标物质的完全反应,使衍生效率达到最大,但过量的NBD-F试剂将增大背景干扰,导致分离效率降低,无法准确定量。本实验在衍生反应pH7.2、衍生反应时间20 min、衍生反应温度40 ℃的条件下,分别考察NBD-F浓度在0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol/L时,对3种α2-受体激动剂平均回收率的影响。

1.2.2.2 衍生反应pH的选择 赛拉嗪、右美托咪啶以及胍那苄的衍生化氨基反应一般是在碱性条件下进行的,本实验在衍生剂NBD-F浓度1.0 mmol/L、衍生反应时间20 min、衍生反应温度40 ℃的条件下,分别考察衍生反应pH在6.6、7.2、7.8、8.3、8.9、9.5、10.1、10.7时,对3种α2-受体激动剂平均回收率的影响。

1.2.2.3 衍生反应时间的选择 衍生反应的时间会对衍生反应的反应程度以及衍生物的量产生影响,本实验在衍生剂NBD-F浓度1.0 mmol/L、衍生反应pH8.9、衍生反应温度40 ℃的条件下,分别考察衍生反应时间在5、10、15、20、25、30、35、40 min时,对3种α2-受体激动剂平均回收率的影响。

1.2.2.4 衍生反应温度的选择 赛拉嗪、右美托咪啶以及胍那苄在高温下不稳定,为了保证目标物的稳定性,实验在衍生剂NBD-F浓度1.0 mmol/L、衍生反应pH8.9、衍生反应时间30 min的条件下,考察衍生反应温度在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃时,对3种α2-受体激动剂平均回收率的影响。

1.2.3 色谱条件的优化 色谱条件:色谱柱选择苯基毛细管电色谱填充柱(50 μm×55 cm,3 μm);流速:0.03 mL/min;进样量:20 μL;柱温:30 ℃。3种α2-受体激动剂的色谱分离选用乙腈-磷酸钾缓冲液流动相体系,分别考察磷酸钾缓冲液的浓度以及乙腈的比例对3种目标物衍生物分离的影响。

1.2.3.1 流动相中磷酸钾浓度的选择 在毛细管电泳色谱分离过程中,流动相的主要驱动力来自压力流、电泳力或电渗流,而流动相的黏度影响电泳迁移率和电渗流的大小,所以本实验固定流动相乙腈-磷酸钾缓冲液(55∶45,v/v)的比例,分别考察磷酸钾浓度为5、10、15、20 mmol/L时,3种α2-受体激动剂衍生物在色谱图上的分离效果。

1.2.3.2 流动相中乙腈比例的选择 在乙腈-磷酸钾缓冲液流动相体系中,乙腈比例的大小影响着流动相的极性,同时也影响目标物的色谱保留行为。本实验固定流动相中磷酸钾浓度为10 mmol/L,分别考察乙腈比例为50%、55%、58%、60%时,3种α2-受体激动剂衍生物在色谱图上的分离效果。

1.2.4 方法学验证 配制一系列不同质量浓度的α2-受体激动剂混合标准溶液(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL),在优化好的荧光衍生和色谱条件下,进行标准曲线的制作、稳定性与重复性实验和加标回收实验。

2 结果与讨论

2.1 荧光衍生反应条件的优化

赛拉嗪、右美托咪啶以及胍那苄的化学结构中没有荧光发色基团,且紫外吸收弱,需要通过NBD-F衍生后才有荧光反应,衍生原理见图1。

图1 NBD-F衍生含氨基化合物的原理图Fig.1 Schematic diagram of derivatization for aminocontaining compounds with NBD-F

衍生反应中,3种α2-受体激动剂与NBD-F的反应程度会影响到待测目标物被检出的量,所以衍生剂浓度、衍生反应pH、衍生反应的时间和温度都对其有影响,本实验要对其进行优化,以达到最优的目标回收率。

2.1.1 衍生剂浓度的选择 由图2可知,在0.1～1.0 mmol/L范围内,随着衍生试剂浓度的增加,3种α2-受体激动剂的检测回收率的逐渐提高,说明衍生反应也越完全,并在1.0 mmol/L时回收率达到最大值,表明衍生反应基本完全;继续增大衍生剂的浓度,将导致衍生试剂和水解产物残留,荧光效率不再增加[18]。因此选择1.0 mmol/L的衍生试剂浓度进行下一步实验。

图2 衍生剂浓度对α2-受体激动剂平均回收率的影响(n=5)Fig.2 Effect of derivatives concentration on average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.1.2 衍生反应pH的选择 由图3可知,衍生反应体系溶液的pH在6.6～10.7范围内,随着pH的增大,反应体系的碱性增强,增加了衍生试剂与α2-受体激动剂的反应的概率,荧光响应有显著提高,当pH为8.9时达到最大;继续增大pH,此时目标物不稳定易分解,造成衍生效率下降,副产物增多[19],因此将反应体系溶液的pH设为8.9。

2.1.3 衍生反应时间的选择 由图4可知,适当延长衍生反应时间有助于荧光衍生效率的提高。当衍生反应在5～30 min范围内,随着衍生反应时间的延长,衍生产物的回收率不断提高;当衍生反应提高到30 min时,3种α2-受体激动剂的衍生产物回收率达到最大值,继续延长衍生反应时间容易使衍生试剂水解产物增多,干扰分析[20]。因此将衍生反应时间设为30 min。

图4 衍生反应时间对α2-受体激动剂平均回收率的影响(n=5)Fig.4 Effect of derivative reaction time on average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.1.4 衍生反应温度的选择 由图5可知,当温度较低时,衍生剂与受体激动剂的反应概率较小,荧光衍生效率较低,随着反应温度逐渐加大,衍生效率逐渐增加,60 ℃时,产物的荧光效率达到最大;再增大反应温度会增加荧光分子与溶剂分子相互碰撞淬灭的概率,使荧光量子产率变小,而且温度过高会产生更多的副产物,干扰对目标物的分离分析[20]。因此最终将衍生反应温度设为60 ℃。

图5 衍生反应温度对α2-受体激动剂平均回收率的影响(n=5)Fig.5 Effect of derivative reaction temperature on the average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.2 色谱条件的优化选择

2.2.1 流动相中磷酸钾浓度选择 结果如图6所示,随着磷酸钾缓冲液浓度的增大,流动相黏度逐渐变大,扩散系数逐渐变小,使得双电层厚度减小,管壁的Zeta电势也逐渐减小,导致电渗流变小,目标物分析时间延长。其中,右美托咪啶和胍那苄荧光衍生产物色谱峰的保留时间增加趋势较明显,这可能是由于在pH5.0时这两种物质带负电荷,电泳方向与电渗流方向相反;赛拉嗪的荧光衍生产物此时更趋向于中性分子,所以色谱峰保留时间主要受电渗流影响,变化略小[17,21]。综合考虑分析物的保留时间、分离度和峰形,实验选择10 mmol/L磷酸钾盐溶液作为流动相缓冲液。

图6 缓冲液浓度对α2-受体激动剂色谱分离的影响Fig.6 Effect of buffer concentration on chromatographic separation of α2-receptor agonists注:峰1和峰2为赛拉嗪;峰3和峰4为右美托咪啶;峰5和峰6为胍那苄;NBD-OH:4-氟-7-羟基-2,1,3-苯并恶二唑;图7同。

2.2.2 流动相中乙腈比例的选择 结果如图7所示,随着乙腈比例的增加,目标物在色谱柱上的保留时间减少,这是由于乙腈比例的增加使得流动相的黏度减小,Zeta电位和电渗流变大,降低了目标物在苯基反相柱上的保留[21]。当乙腈的体积分数超过55%时,虽然分析物的响应值有明显的增大,但是分离度却有所降低[22]。综合考虑,将流动相中乙腈的体积分数设为55%。

图7 乙腈比例对α2-受体激动剂分离的影响Fig.7 Effect of ACN ratio on the separation of α2-receptor agonists

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线的制作 实验结果表明,3种目标组分在1.0～20.0 ng/mL内均具有良好的线性关系(R2>0.99),并得到3种目标组分的LOD均为5.0 μg/kg,LOQ均为16.0 μg/kg,结果见表1。

表1 3种α2-受体激动剂的标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1 Standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of three α2-receptor agonists

现有α2-受体激动剂分析方法可以参考饲料中可乐定和赛庚啶的测定的标准方法[5-6],采用UPLC-MS/MS法,其使用成本与操作要求均较高,检出限为50 μg/kg。本方法无需梯度洗脱,衍生快速高效,检出限更低,而且可以避免大量非荧光杂质的干扰,对于运动营养品食品中α2-受体激动剂类物质的检测具有适用性。

2.3.2 稳定性与重复性 在最优条件下,对20.0 ng/mL的3种α2-受体激动剂物质混合标准溶液进行荧光衍生和CEC-LIF检测分析,连续测定7 d,每天进样3次,测得3种目标物保留时间的日间和日内相对标准偏差(RSD)分别为3.5%～8.6%和3.1%～3.7%;峰面积的日间和日内RSD分别为3.3%～7.5%和2.6%～2.9%。说明该方法的稳定性和重复性均良好,可用于3种α2-受体激动剂物质的分析研究。

2.4 加标回收实验

利用空白基质的样品进行加标回收率实验,测定结果见表2。

表2 方法的回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of the method(n=5)

由表2可见,3种α2-受体激动剂的加标回收率为80.5%～93.4%,RSD为2.4%～7.1%,表明本实验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

3 结论

本文建立了一种毛细管电色谱与激光诱导荧光联用检测运动营养品中赛拉嗪、右美托咪啶、胍那苄等3种α2-受体激动剂的分析方法。衍生反应选择NBD-F浓度为1.0 mmol/L、衍生反应pH为8.9、衍生反应时间为30 min以及衍生反应温度为60 ℃的条件下,以乙腈-磷酸钾(10 mmol/L)(55∶45,v/v)为流动相,经苯基毛细管色谱填充柱进行分离,3种α2-受体激动剂能在1.0～20.0 ng/mL内均具有良好的线性关系,3种组分的LOD均为5.0 μg/kg,LOQ均为16.0 μg/kg。样品中3种α2-受体激动剂的加标回收率为80.5%～93.4%,相对标准偏差为2.4%～7.1%,所建立的方法有效解决了测定这类α2-受体激动剂样品时样品前处理复杂、回收率低的分析难点,可为运动营养品中α2-受体激动剂的分析和监控提供技术支持。