PMP柱前衍生化HPLC法测定地参多糖的单糖组成

黄小兰，何旭峰，杨勤，张椿翊，周浓

1(重庆三峡学院 生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 万州，4041200 2(重庆市万州食品药品检验所，重庆 万州，404120)3(重庆三峡医药高等专科学校 中医学院，重庆 万州，404120)

地参俗称虫草参、银条菜、瓜儿苗，为唇形科植物毛叶地瓜苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtusRegel)的干燥根茎，是一种传统的药食兼用佳品[1-2]。地参含有丰富的多糖类、萜类与甾体、酚酸类、黄酮类、挥发油等化合物[3-6]，其中地参多糖因具有抗氧化[7]、抗肿瘤[8]、免疫调节[6,9]、降血糖[10]等生物活性而备受关注。

地参在我国分布较为广泛，主要产区包括云南、重庆、山东、四川、陕西、河北及东北等地[11]。目前有关地参多糖的研究多集中于总多糖的提取工艺优化[12-14]及其生物活性[7-10]方面，但是对地参多糖整体的单糖组成分析及深入研究鲜见报道。而植物多糖的生物活性与其单糖组成、比例等密切相关[15-18]。本研究采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)柱前衍生化法[19-22]，即单醛糖在碱性条件下，与PMP相结合生成具有紫外吸收的化合物，建立高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(high performance liquid chromatography-photo diode array, HPLC-PDA)检测地参单糖组成的方法，并通过主成分分析对不同产地的地参样品中单糖进行差异分析，旨在为地参多糖的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地参采自或委托采集于云南、重庆、广西、江苏、山东等地参栽培基地(表4)，鉴定为唇形科植物毛叶地瓜苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtusRegel)的干燥根茎。

D-甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、D-半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖标准品(批号分别为：DST170307-047、DST190315-033、DST1180427-567、DST190312-063、DST190304-011、DST180427-565，纯度均≥98%以上)，成都德思特生物技术有限公司；半乳糖醛酸标准品(批号：111646-200301，纯度≥98%以上)，中国食品药品检定研究院；D-无水葡萄糖标准品(批号：Must-3122601，纯度≥98%以上)，成都曼思特生物科技有限公司。

石油醚(60～90 ℃)、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸(TFA)、HCl、NaOH、PMP、NaH2PO4、Na2HPO4均为分析纯，成都科龙化学品有限公司；色谱纯乙腈，迪马科技公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AT型高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器PDA)，日本岛津公司；Milli-Q Advantage A10型超纯水机(电阻率≥18.2 MΩ·cm)，美国Millipore公司；Sigma 4-16S型与Sigma 3-30KS型高速离心机，德国Sigma公司；IKA MS3型涡旋混合器，德国IKA公司；Sartorius SQP电子分析天平(精密度为0.01 mg)，德国Sartorius公司；KH-2000DB型超声波清洗机(功率2 000 W，频率40 kHz)，昆山禾创超声仪器有限公司；DZKW-S-6型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；BPG-9240A型精密鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品溶液的制备

分别称取D-甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、D-无水葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖8种单糖对照品适量，用水溶解制得质量浓度分别为0.672 2、1.330 8、0.834 0、0.568 0、2.071 7、2.039 4、0.514 5、0.576 2 mg/mL的对照品储备液，并逐级稀释成不同质量浓度的混合对照品溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

1.3.2.1 地参多糖的提取[12-14]

地参样品经50 ℃干燥，粉碎过35目筛，备用。

脱脂：取一定量的地参粉末，加入适量石油醚(60～90 ℃)，在60 ℃水浴中回流1.5 h脱脂，挥干溶剂。

提取：准确称取1 g(精确至0.000 1 g)脱脂后的样品于50 mL离心管中，加入10 mL 80 ℃蒸馏水超声提取(功率300 W，频率40 kHz)，30 min取出放至室温，加入Sevage试剂[V(正丁醇)∶V(三氯甲烷)=1∶5]10 mL，涡旋2 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于锥形瓶中，加水10 mL，重复操作2次，合并上清液，加入5倍体积的无水乙醇，摇匀。于4 ℃条件下静置24 h，离心，弃去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀2次，除掉单糖及低聚糖成分，水浴挥干无水乙醇，用水将沉淀溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，制得地参多糖溶液，备用。

1.3.2.2 地参多糖的水解

取上述地参多糖溶液1.0 mL于顶空瓶中，加入2.0 mol/L三氟乙酸溶液2.0 mL，迅速密封。110 ℃条件下水解5 h，取出，冷却至室温，用5 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，转移至5 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀备用。

1.3.2.3 地参单糖的衍生

分别取1.3.1的单糖混合标准溶液及1.3.2.2中的地参多糖水解溶液200 μL于10 mL离心管中，加入0.5 mol/L NaOH溶液200 μL，混匀，再加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液500 μL，混匀，在70 ℃水浴条件下衍生1 h，取出，冷却至室温，加入0.5 mol/L HCl溶液200 μL，混匀，加入三氯甲烷1.0 mL，涡旋1 min，8 000 r/min冷冻离心5 min，弃去下层液，重复3次，除掉多余的PMP溶液，取上清液定容至2 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.3.3 色谱条件[19-20,22]

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长249 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；流动相：A为乙腈，B为0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.75)，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 单糖衍生物的梯度洗脱程序

1.3.4 地参多糖水解条件的单因素实验

1.3.4.1 三氟乙酸浓度的考察

分别取1.0 mL多糖水溶液(S1)于5个顶空瓶中，平行3份，分别加入2.0 mL浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的三氟乙酸溶液，110 ℃水解5 h，以水解后的葡萄糖、半乳糖含量以及单糖总含量考察三氟乙酸溶液浓度的影响。

1.3.4.2 水解温度的考察

分别取1.0 mL多糖水溶液(S1)于5个顶空瓶中，平行3份，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2.0 mL，分别在80、90、100、110、120 ℃水解5 h，以水解后的葡萄糖、半乳糖含量以及单糖总含量考察水解温度的影响。

1.3.4.3 水解时间的考察

分别取1.0 mL多糖水溶液(S1)于5个顶空瓶中，平行3份，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2.0 mL，于110 ℃下分别水解3、4、5、6、7 h，以水解后的葡萄糖、半乳糖含量以及单糖总含量考察水解时间的影响。

1.3.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件和SPSS 22.0软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 流动相体系的选择

参考文献[19-20,22]，流动相体系主要为磷酸盐缓冲液-乙腈反相等度洗脱。本试验采用V(0.1 mol/L磷酸盐缓冲液)∶V(乙腈)=83∶17等梯度洗脱时，8种单糖衍生物均能够很好的分离，但是分析时间长达65 min。提高乙腈比例可以有效缩短分析时间，但是会造成鼠李糖和葡萄糖醛酸分离度不够，故本试验采用梯度洗脱，既能达到良好的分离度，同时缩短分析时间，目标物在45 min出峰完成。在优化后的色谱条件下对标准品和样品进行测定，结果见图1。

1-甘露糖；2-鼠李糖；3-葡萄糖醛酸；4-半乳糖醛酸；5-葡萄糖；6-半乳糖；7-阿拉伯糖；8-岩藻糖

2.2 地参多糖水解条件的确定

2.2.1 三氟乙酸浓度对地参多糖水解的影响

由图2可知，随着三氟乙酸浓度的增大，地参多糖水解能力增强，相应的单糖含量增多，当浓度大于2.0 mol/L时，单糖含量略有下降趋势，这可能与多糖在高浓度酸的条件下发生水解逆反应有关，故本实验选择三氟乙酸的浓度为2.0 mol/L。

图2 三氟乙酸浓度对地参多糖水解的影响

2.2.2 水解温度对地参多糖水解的影响

由图3可知，随着水解温度的升高，地参多糖糖苷键水解成单糖的速率加快，温度在110 ℃后单糖含量基本稳定，表明地参多糖已经水解完全，故本方法确定水解温度为110 ℃。

图3 水解温度对地参多糖水解的影响

2.2.3 水解时间对地参多糖水解的影响

由图4可知，随着水解时间的延长，地参多糖水解效率提高，在5 h内达到峰值随后趋于稳定，表明地参多糖已经水解完全，为了缩短分析时间、节约能源，本实验确定水解时间为5 h。

图4 水解时间对地参多糖水解的影响

2.2.4 最佳条件的确定

根据单因素实验结果，地参多糖完全水解最佳条件为：三氟乙酸浓度2.0 mol/L，水解温度110 ℃，水解时间5 h。

2.3 线性关系、检出限的考察

取1.3.1的8种单糖混合标准工作液按照1.3.2.3的步骤进行衍生，以1.3.3的色谱条件依次进样分析，记录色谱峰面积，以各单糖标准品的峰面积(y)与其相应的质量浓度(x)进行线性回归，绘制标准曲线，根据信噪比计算检出限(RS/N=3)，结果如表2所示。8种单糖的相关系数均大于0.999 5，表明线性关系良好；8种单糖的检出限范围为0.16～0.85 μg/mL，表明仪器灵敏度高。

2.4 仪器精密度考察

取同一衍生后的标准品溶液按照1.3.3的色谱条件连续进样6次，记录各单糖色谱峰峰面积，并计算相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)值。结果表明：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖峰面积的RSD值分别为0.50%、0.38%、0.60%、0.56%、1.09%、1.20%、0.37%、0.38%，均小于1.50%，表明仪器精密度良好，可进行样品分析。

表2 八种单糖的标准曲线、线性范围、相关系数和检出限

2.5 衍生试样稳定性考察

取衍生后的样品溶液(S1)，分别在0、2、4、8、12、16、24 h时间点按照1.3.3进样，计算各单糖色谱峰的RSD值。结果表明：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖峰面积的RSD值分别为2.81%、1.55%、2.64%、1.90%、0.26%、0.71%、1.92%、2.75%，表明单糖经衍生后生成的物质在24 h内稳定性良好，对进样时间无特殊要求。

2.6 方法重复性考察

精密称取样品(S1)1.0 g，平行6份，按照1.3.2制备样品溶液，并按1.3.3的色谱条件进样测定，记录各单糖色谱峰峰面积，并计算RSD值。结果表明：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖峰面积的RSD值分别为2.86%、2.15%、1.17%、2.10%、0.25%、0.68%、1.83%、3.07%，表明该方法的重复性良好，可用于其他地参样品中单糖的组成和含量测定。

2.7 加标回收试验考察

移取制备好的多糖样品溶液(S1)0.50 mL于顶空瓶中，分别加入高、中、低3个水平的混合标准储备液，按照1.3.2.2及1.3.2.3进行水解、衍生化操作，各加标水平平行测定6次，计算回收率及RSD值，见表3。

表3 八种单糖的回收率测定结果(n=6)

结果表明8种单糖高、中、低3个水平的平均回收率为82.58%～108.71%，RSD值为0.03%～1.44%，表明该方法的准确性好，精密度高。

2.8 地参多糖的单糖组成及含量

取6个不同产地地参样品按照1.3.2进行制备样品溶液，注入高效液相色谱仪测定其多糖中单糖组成及含量，并计算各单糖组分间物质的量比，结果见表4、表5。地参样品中均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖8种单糖，但含量上存在一定的差异，甘露糖的含量为0.099～0.230 mg/g，鼠李糖的含量为0.048～0.114 mg/g，葡萄糖醛酸含量为0.052～0.093 mg/g，半乳糖醛酸含量为0.150～1.429 mg/g，葡萄糖含量为26.063～47.666 mg/g，半乳糖含量为98.693～145.308 mg/g，阿拉伯糖含量为0.454～0.566 mg/g，岩藻糖含量为0.099～0.176 mg/g。同时，从表4可以看出地参中半乳糖、葡萄糖的含量较高，为地参单糖的主要成分。由表5可知，8种单糖组分的平均物质的量比为：甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶岩藻糖=1.00∶0.60∶0.54∶5.15∶266.53∶890.11∶4.12∶1.05。

表4 地参多糖的单糖组成及含量 单位：mg/g

表5 地参多糖中单糖的物质的量比(n=3)

2.9 主成分分析

采用SPSS 22.0软件对6个样品的单糖含量进行主成分分析，并对其进行主成分得分计算以及排序，结果见表6、表7。

表6 样品主成份距阵

表7 样品主成分得分、综合得分及其排序

注：PC1,PC2为主成分得分；C为综合得分

从多糖的8个单糖组分中提取出了2个主成分(特征值>1)，主成分1的特征值为5.334，特征贡献率为66.67%；主成分2的特征值为1.180，特征贡献率为14.75%，2个主成分的累积贡献率为81.42%。主成分1中岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖为主要影响因子；主成分2中甘露糖、葡萄糖醛酸为主要影响因子。

根据得分排序来看：相对于主成分1，采自山东菏泽的地参得分最高；相对于对主成分2，采自江苏徐州的地参得分最高；说明采自山东菏泽、江苏徐州单糖成分含量较高。综合得分排序由高到低依次为：山东菏泽、江苏徐州、广西玉林、云南腾冲、重庆万州、云南大理。说明地参单糖含量的高低在我国地域上呈现出北方>南方>西南的趋势，这可能与日照时间、昼夜温差等因素影响了糖分的积累有关[23-24]。

3 结论

不同产地地参多糖均具有相似的单糖组成，即甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖等，其中半乳糖、葡萄糖为主要成分，但各单糖含量及组成比例有明显差异。因此，基于地参多糖的特征单糖组分分析研究，有助于完善地参的质量控制与开发利用。

本研究建立了水提醇沉法、PMP柱前衍生HPLC法测定地参多糖中8种单糖组成和含量，该方法的灵敏度高、分离效果好，线性范围宽、检出限低，精密度、重复性、稳定性和回收率良好，操作简便，结果稳定可靠，可用于地参样品中多糖的单糖组成分析及定量测定，也可为其他药食同源植物多糖组成研究提供参考。