LCST 型离子液体-盐双水相体系提取虾青素

张莉莉 高 静，2，3* 魏媛仪 聂芳红 吉宏武，2，3 刘书成，2，3 毛伟杰，2，3

（1 广东海洋大学食品科技学院 广东湛江 524088 2 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室 广东湛江 524088 3 广东省水产品加工与安全重点实验室 广东湛江 524088）

虾青素（3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素）分子结构紫罗酮环上的羟基和酮基使其具有突出的抗氧化活性[1-2]。此外，虾青素还具有抗脂质过氧化[3-4]，免疫调节[5]，抗癌变[6-7]及心血管疾病预防[8]等生理功能。然而，化学合成的虾青素存在生产成本高、安全风险大以及潜在的环境问题。从生物资源中获取天然虾青素的研究日益受到重视。雨生红球藻富含虾青素，然而，其细胞壁对外界的生物或化学作用具有一定抵抗力，使得虾青素的提取难度增大[9]。常见的提取方法包括油溶法[10]、有机溶剂法[11]以及超临界流体法[12]。油溶法提取虾青素耗时长且提取温度高，不利于保持虾青素的稳定性。有机溶剂法存在较大的环境风险，而超临界萃取操作复杂，对设备要求高。从雨生红球藻中获取虾青素往往采用机械破壁或化学破壁，之后采用有机试剂提取[13-14]。分步提取法不仅工艺复杂，而且不利于操作者的健康。探索一步法实现对雨生红球藻的高效破壁和虾青素的提取十分重要。

离子液体（Ionic liquids，ILs）通常由不对称的有机阳离子和有机或无机阴离子组成，具有溶解能力强、熔点低、热稳定性好等优点。近年来，离子液体作为有机溶剂（丙酮等）的助剂已成功应用于虾青素的提取[15-18]。如何减少使用或者不使用有机试剂，建立更加绿色的虾青素提取技术和理论，是提取天然虾青素及其应用研究亟待解决的基础科学问题。双水相体系利用生物分子在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取[19-20]。近年来，离子液体参与构筑的新型双水相体系因具有环境友好，分离条件温和，能耗低且生物相容性高等优点，在生物分子萃取领域得到广泛关注[21-24]。

离子液体的结构、盐离子的水合吉布斯自由能、溶液pH 值和环境温度是影响离子液体-盐双水相体系形成及生物分子在两相间迁移的重要因素[25-27]。其中，温度对离子液体-盐双水相体系的作用复杂，始终存在争议。一方面，以Zafarani-Moattar 等[28]为代表的学者认为温度对离子液体-盐双水相体系的作用并不显著，有关离子液体-盐双水相的许多萃取研究是在恒定温度下进行的[29-30]。另一方面，Sadeghi 等[31]指出，离子液体-盐双水相的成相能力随温度的升高而减弱，表现出具有高临界共熔温度（Upper critical solution temperature，UCST）的相转变行为。这一结论在其它相关研究中得到普遍支持[27，32]。然而，本课题组最新研究发现，由四辛基膦溴盐（[P4448]Br）和磷酸钾（K3PO4）构成的离子液体-盐双水相的成相能力随着温度的升高而增强，表现出具有低临界共熔温度（Lower critical solution temperature，LCST）的相转变行为[33]。UCST 型离子液体双水相体系已在分离蛋白质[34-35]、酶[36]等方面获得广泛肯定。然而，以虾青素作为类胡萝卜素的模型，对其在离子液体-盐双水相体系中分配特性的研究尚未见报道。

本文以K2HPO4/KH2PO4替代K3PO4，以季铵盐和季膦盐离子液体替代咪唑盐离子液体，进一步构建pH 值和温度均可调控的新型LCST 型离子液体-盐双水相体系，系统考察该体系相行为规律，以及虾青素在两相间的迁移特性，并从雨生红球藻中提取天然虾青素，旨在为采用双水相分离技术从生物资源中提取天然虾青素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雨生红球藻粉（虾青素含量2%），西安天象生物工程有限公司；虾青素标准品（纯度＞99%），上海源叶生物科技有限公司。

三水合磷酸氢二钾K2HPO4·3H2O（纯度＞99%），广州市金华化学试剂有限公司；磷酸二氢钾KH2PO4（纯度＞99%），天津市百世化工有限公司；甲醇（纯度＞99.9%），广州金华化学试剂有限公司；辛基三丁基溴化膦（[P4448]Br）、辛基三丁基氯化膦（[P4448]Cl）、四丁基溴化膦（[P4444]Br）、四丁基氯化膦（[P4444]Cl）、四丁基三氟乙酸膦（[P4444]CF3COO）、四丁基溴化铵（[N4444]Br）、四丁基氯化铵（[N4444]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（[C4mim]Br）、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[C4mim]Cl）（纯度均＞99%），兰州中科科特工贸有限公司；虾青素和离子液体的阳离子结构如图1 所示。

图1 离子液体阳离子和虾青素的化学结构Fig.1 Chemical structures of ionic liquid cations and astaxanthin

1.2 仪器与设备

LD-20AD 凝胶渗透液相色谱仪，日本岛津公司；KQ-300 超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；HH-6 数显电子恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；AW120 电子天平，日本岛津公司；DNP-9025 电热恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 离子液体-K2HPO4/KH2PO4双水相体系相图绘制 双水相体系相图绘制采用“浊点”法[33]。准确称取0.2 g 离子液体于试管，置于恒温水浴锅（25，35，45，55 ℃），随后向试管中逐滴加入K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液（pH 5～9），至混合体系由澄清变为混浊，计算并记录各组分的质量百分数，再逐滴加入水至体系变澄清，如此反复操作，绘制双水相体系相图。

1.3.2 虾青素含量测定 色谱柱：C18；柱温：30℃；流动相：甲醇；流速：1.00 mL/min；检测波长：477 nm；进样量：20 μL。

1.3.3 虾青素分配系数（KAst）通过高效液相色谱法分别测得双水相体系各相中虾青素浓度，按公式（1）计算KAst。

式中，[Ast]IL、[Ast]Salt——离子液体富集相和盐富集相中的虾青素浓度，mg/g。

1.3.4 从雨生红球藻提取虾青素 向[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系中加入0.01 g 雨生红球藻粉，于75 W 超声辅助萃取60 min，随后将其置于恒温培养箱中静置12 h，分别取上下相的虾青素溶液于棕色容量瓶中定容，过0.45 μm 有机膜，用高效液相色谱法测定。为了与有机试剂提取虾青素的结果相比较，采用丙酮、乙醇作为提取剂，在相同条件下提取。虾青素提取量按公式（2）计算。

式中，X——虾青素提取量，mg/g；c——由标准曲线得到的虾青素质量浓度，mg/mL；V——提取液体积，mL；N——稀释倍数；m——雨生红球藻粉质量，g。

虾青素提取率按公式（3）计算。

式中，ω——虾青素提取率，%；X——虾青素提取量，mg/g；Y——雨生红球藻粉中总虾青素含量，mg/g。

1.4 数据处理方法

所有试验平行测定3 次，计算平均值和标准差。采用JMP 软件（SAS 公司）对数据进行方差分析（One-way anova），P＜0.05 时具有统计学差异。Excel 软件回归拟合试验数据，Origin 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 LCST 型离子液体-K2HPO4/KH2PO4 双水相体系的构建及其相行为规律

2.1.1 离子液体种类对相行为的影响 生物分子在液-液萃取体系中的分配关系往往与该萃取体系的相行为密切关联。首先研究9 种离子液体-K2HPO4/KH2PO4双水相体系在25 ℃下的相平衡规律，其双节线相图如图2 所示。由相同阴离子和不同阳离子构成的离子液体与K2HPO4/KH2PO4形成双水相的能力表现为：[P4448]+＞[P4444]+≈[N4444]+＞[C4mim]+。与[P4444]+相比，[P4448]+具有更长的侧链，且摩尔体积较大，疏水性更强，因此成相能力最好[37]。与四元盐相比，咪唑基离子液体阳离子具有电荷扩散，使得阳离子与水分子之间的相互作用更强。因此，[P4444]+和[N4444]+比咪唑基离子液体具有更强的疏水性，其成相能力也更好。

另一方面，离子液体阴离子形成双水相体系的能力，与其氢键接受强度或电子对贡献下降密切相关[38]。从图2 可以看出，不同阴离子的离子液体与K2HPO4/KH2PO4形成双水相的能力大小为：[CF3COO]-＞[Br]-＞[Cl]-。[CF3COO]-具有较高电荷密度，成相能力较强。Br-可形成较强的库仑力，而且与Cl-相比，其从水中接受质子能力较弱，促使离子液体对水分子亲和力较低，而利于相分离[23，39]。

图2 25 ℃下离子液体-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）双水相体系双节线相图Fig.2 Phase diagrams of IL-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）ABSs at 25 ℃

2.1.2 温度对相行为的影响 温度是决定离子液体双水相形成能力的重要因素之一。研究表明，大多数咪唑盐离子液体-水二元体系表现出UCST型相变行为[27]。2011 年，Kohno 等[40]首次提出[P4444]CF3COO-H2O 二元体系为LCST 型相转变。前期研究证明，[P4444]CF3COO-K3PO4和[P4448]Br-K3PO4双水相体系也表现为LCST 型相转变行为[33]。在此，进一步探讨不同温度下的9 种离子液体-K2HPO4/KH2PO4-水混合物体系的相行为特征。由表1 可知，[P4448]Br、[P4448]Cl、[P4444]Br、[P4444]Cl、[P4444]CF3COO以及[N4444]Br 这6 种离子液体可以与K2HPO4/KH2PO4形成LCST 型双水相体系。图3 为LCST型离子液体-K2HPO4/KH2PO4双水相体系随温度变化的双节线相图。

图3 不同温度下LCST 型离子液体-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）双水相体系双节线相图Fig.3 Phase diagrams of LCST-type IL-K2HPO4/KH2PO4（pH 8）ABSs at different temperatures

表1 离子液体-K2HPO4/KH2PO4-水混合物体系的相行为特征Table 1 Phase behavior of IL-K2HPO4/KH2PO4-water mixture system

2.1.3 pH 值对相行为的影响 K3PO4电荷密度高，比K2HPO4、KH2PO4对水的结合能力更强[38，41]，然而，由缓冲盐引起的pH 值变化对双水相的形成以及对生物分子的提取作用，均不容忽略。Ferreira等[42]发现[P4444]Cl-K3C6H5O7/C6H8O7双水相体系随pH 值的升高成相能力呈增大趋势。然而，在pH 5～8 的范围内，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系随pH 值的变化并不显著（图4），这可能是因为[P4448]Br 疏水性强，溶液体系电荷密度在该pH 值范围内未发生显著变化。

图4 25 ℃下不同pH 值的[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系双节线相图Fig.4 Phase diagrams of[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4 ABSs at different pH value

2.2 虾青素在LCST 型离子液体-K2HPO4/KH2PO4 双水相体系中的分配规律

2.2.1 离子液体种类对虾青素分配系数的影响由于萃取体系的表面性质、电荷作用和其它作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在，使生物分子在上、下相的浓度有所差异，分配系数大于1 表明两相的疏水性差异利于目标提取物的分离[19]。图5 为虾青素在不同离子液体-K2HPO4/KH2PO4双水相体系中的分配系数。虾青素在[P4448]Br、[P4448]Cl、[P4444]Br、[P4444]Cl、[P4444]CF3COO 以及[N4444]Br 参与构筑的双水相体系中的KAst均大于1，表明虾青素主要迁移到这6 种离子液体富集相中。这主要由于虾青素紫罗酮环上的羟基与离子液体阳离子上的氢原子之间形成氢键作用，其中[P4448]Br 阳离子中氢原子最多，与虾青素氢键作用最强。因此，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系在25 ℃，pH 8，离子液体质量浓度0.26 g/g 的条件下获得最大虾青素分配系数（KAst=6.44）。与此相反，[C4mim]Cl和[C4mim]Br 双水相体系具有UCST 型相转变行为，在此条件下，KAst小于1。由此可见，LCST 型离子液体双水相体系比UCST 型离子液体双水相体系具有更强的虾青素提取能力，而且离子液体形成双水相的能力与虾青素的分配系数存在密切相关。

2.2.2 离子液体浓度对虾青素分配系数的影响离子液体与虾青素的相互作用是虾青素迁移到离子液体富集相的内在动力。如图6 所示，KAst随[P4448]Br 质量浓度的增加呈先增加后降低的趋势，当[P4448]Br 质量浓度为0.25 g/g 时，KAst最大为14.59。这是因为随着[P4448]Br 初始质量浓度的增加，体系各相疏水性差异不断增加，虾青素与离子液体的相互作用增强，利于虾青素向离子液体富集相转移。然而，过量的离子液体会导致离子液体富集相中水分含量减少，相体积减小，黏度增加，因此不利于虾青素的迁移。

图5 虾青素在不同IL-K2HPO4/KH2PO4 双水相体系中的分配系数（25 ℃，pH 8，cIL=0.26 g/g）Fig.5 KAst in different IL-K2HPO4/KH2PO4 ABS（25 ℃，pH 8，cIL=0.26 g/g）

图6 [P4448]Br 质量浓度对虾青素分配系数的影响（25 ℃，pH 8）Fig.6 Effect of[P4448]Br mass concentrations on the KAst（25 ℃，pH 8）

2.2.3 温度对虾青素分配系数的影响 离子液体在双水相各相中的浓度不仅受离子液体自身阴、阳离子种类的影响[26]，而且受到温度的影响[31，33]。对于LCST 型离子液体双水相体系，升高温度使得离子液体的疏水性增强，其在两相中的浓度差异增加[43]。这种由温度变化而引起的离子液体浓度差异最终会导致目标提取物在两相间分配系数的变化。由图7 可知，[P4444]CF3COO-K2HPO4/KH2PO4双水相中KAst随温度的升高而增大，说明高温利于虾青素向[P4444]CF3COO 富集相迁移。此结果与图6 所示[P4448]Br 质量浓度对虾青素分配系数的影响规律结果相吻合。值得注意的是，升高温度利于虾青素向[P4448]Br 富集相迁移。35 ℃时，KAst达到最大值23.41。然而，进一步生高温度反而使KAst降低。这可能因为继续升高温度加速了相分离，[P4448]Br 质量浓度的增加使离子液体相的黏度增大，不利于虾青素的迁移。另一方面，高温可能引起虾青素稳定性下降，不利于其分离提取[6]。

2.2.4 pH 值对虾青素分配系数的影响 虽然[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系的成相能力受pH 值的影响不显著，但是虾青素在该双水相体系中的分配系数随pH 值的变化情况不容忽视。由图8 可见，碱性环境更利于虾青素的提取。可能因为在碱性条件下离子液体富集相具有较高的电荷密度，与虾青素作用更强。与此相近，通过加入KOH 以调节体系pH 值，促使1-丁基-1-甲基哌啶鎓氯化物与柠檬酸钾和柠檬酸混合物所构成的双水相体系，从果糖中分离羟甲基糠醛[44]。因此，利用LCST 型离子液体双水相体系从生物资源中提取天然虾青素，必须控制适当的温度和pH范围。综上所述，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系成相能力最佳，表现为具有LCST 型特点的相转变行为，并且在[P4448]Br 质量浓度为0.25 g/g，温度35 ℃，pH 9 时，虾青素分配系数达到最大。

图7 不同温度下虾青素在IL-K2HPO4/KH2PO4双水相体系中的分配系数（pH 8，cIL=0.25 g/g）Fig.7 KAst in IL-K2HPO4/KH2PO4 ABS at different temperatures（pH 8，cIL=0.25 g/g）

图8 不同pH 值下虾青素在[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系中的分配系数（25 ℃，cIL=0.25 g/g）Fig.8 KAst in[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4 ABS at different pH value（25 ℃，cIL=0.25 g/g）

2.3 [P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4 双水相体系从雨生红球藻中提取虾青素

以雨生红球藻为原料，利用[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4双水相体系（pH 9），在超声功率75 W、超声时间60 min 辅助条件下提取虾青素，结果见表2。[P4448]Br 双水相体系从雨生红球藻中提取虾青素的能力远高于丙酮和乙醇，提取量达到19.22 mg/g，提取率高达96.09%。此外，本研究所采用的LCST 型双水相体系具有环境友好，操作简单，分离条件温和，虾青素提取率高的优点。

3 结论

本文构建了新型离子液体-盐双水相体系，考察了其相行为规律及虾青素的分配特性，并从雨生红球藻中提取虾青素。结果表明，[P4448]Br、[P4448]Cl、[P4444]Br、[P4444]Cl、[P4444]CF3COO 以及[N4444]Br 这6 种离子液体可与K2HPO4/KH2PO4形成LCST 型双水相体系。与UCST 型离子液体-盐双水相体系相比，LCST 型离子液体-盐双水相体系的成相能力随着温度升高而增强，利于虾青素的分离。虾青素与离子液体阳离子之间的相互作用使其主要分配于离子液体富集相，不同离子液体双水相的KAst规律为[P4448]Br＞[P4444]CF3COO＞[P4444]Br＞[N4444]Br＞[P4448]Cl＞[P4444]Cl。当pH 9，超声功率75 W，超声时间60 min 时，[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO 双水相体系从雨生红球藻中可获得虾青素的萃取率为96.09%，优于丙酮和乙醇。研究结果为设计对虾青素具有良好萃取效果的液-液萃取体系提供了重要理论依据。

表2 [P4448]Br 双水相体系与其它体系萃取虾青素的比较Table 2 Comparison of[P4448]Br-based ABS with some published method for astaxanthin extraction