基于UPLC-QTOF-MS 和HPLC-QQQ-MS 技术的鹰嘴豆酚类化合物定性、定量分析及其抗氧化能力研究

李文婷 李红艳 邓泽元 张 兵

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌 330047）

鹰嘴豆（Chickpea，Cicer arietinum L）属于高营养豆类作物，在中国新疆地区有逾2500 年的种植历史[1]。作为药食两用植物资源，鹰嘴豆不仅富含矿物质、淀粉、蛋白质等营养素，而且还含有黄酮、皂苷、胆碱、肌醇、维生素及低聚糖等生物活性成分[2]。研究表明，鹰嘴豆提取物具有降血脂[3]、降血糖[4-5]、抗肿瘤[6]、抗菌、抗氧化[7]、改善学习记忆[8]及对阿尔茨海默病的保护作用[9]。此外，鹰嘴豆含44.09%的淀粉，明显低于玉米（70.2%）、荞麦（69%）、燕麦（60%）中的淀粉含量，是糖尿病患者的理想低糖食品[10]。

豆类作物具有较高的抗氧化活性，与其所含的黄酮、酚酸等物质密切相关[11-13]。有研究结果显示[14-16]，植物中存在的天然抗氧化剂，如类胡萝卜素、生育酚、多酚等，食用后可用于慢性疾病的预防，保持身体健康。植物中含有丰富的天然多酚类物质，主要包括黄酮、酚酸和单宁类物质[17]。目前对植物中酚类物质的研究主要为：可溶性酚类和结合态酚类，可溶性酚类可经有机溶剂直接提取得到，提取后的残渣进行结合态酚类研究，而结合态酚类不能直接通过有机溶剂提取获得。其中，可溶性酚类提取物除以游离形态存在，还可与其它物质以键合态形式结合，如醚键、糖苷键、酯键[18]。王毕妮等[17，19-20]以红枣为原料，对红枣中的游离态、酯键合态、糖苷键合态和碱解结合态酚类物质进行研究。原料经有机溶剂提取后，对上清液进行浓缩及萃取处理，萃取后的有机相为游离态酚类；萃取后的水相使用碱溶液处理，可得到酯键合态酚类；酯键合态萃取后的水相使用酸溶液处理，可得到糖苷键合态酚类。

目前，关于鹰嘴豆所含酚类物质的形态、含量及不同键合态的抗氧化能力，鲜见研究报道。基于前人对鹰嘴豆植物化学物质的分析，植物中酚类物质的研究，本文以鹰嘴豆80%甲醇提取物为研究对象，对不同键合态存在的酚类物质含量进行测定，评价其体外抗氧化能力，同时采用液相-质谱联用技术对鹰嘴豆80%甲醇提取物中酚类物质进行定性、定量分析，以进一步了解鹰嘴豆的营养保健作用，为开发鹰嘴豆相关高值化产品提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 原料

鹰嘴豆，江西省南昌市当地超市。

1.2 试剂及检测仪器

芦丁、没食子酸、染料木苷、儿茶素、牡荆素、原儿茶酸、槲皮素、对羟基苯甲酸、黄豆苷、对香豆酸、黄豆黄苷、TPTZ、Trolox、ABTS，阿拉丁；DPPH，西亚试剂；乙醚，国药试剂；福林酚，上海荔达生物科技有限公司；无水甲醇、三水醋酸钠、冰醋酸、盐酸、乙酸乙酯、硫酸、K2S2O8、FeCl3·6H2O、NaOH，西陇科学；AlCl3，恒兴试剂；Na2CO3、NaNO2、FeSO4，西陇化工股份有限公司。

BioTek 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；6538-飞行时间质谱仪HPLC-ESI-Q-TOF-MS、6430-三重串联四级杆质谱仪HPLC-ESI-QQQMS，美国Agilent 公司。

1.3 酚类物质提取及测定

使用80%甲醇∶水（V/V）溶液进行可溶性酚类提取，料液比为1∶15，使用超声波萃取仪于室温下提取1 h，离心机转速4 200×g 离心10 min 进行上清液的收集，提取过程重复4 次，合并所得提取液，用于下述3 种存在形式酚类提取及研究，于-20 ℃储存备用。

1.3.1 不同存在形式酚类提取液的制备[17，19-20]游离态：鹰嘴豆经80%甲醇提取的上清液于35 ℃旋转蒸发至20 mL，使用盐酸溶液（6 mol/L）将pH 值调至2 用于游离态酚类萃取，萃取液为20 mL 乙醚和乙酸乙酯混合溶液（体积比1∶1），收集有机相，重复5 次萃取过程，合并所得有机相，在35 ℃下旋转蒸发至干，用5 mL 80%甲醇复溶，于-20℃储存备用。

酯键合态：将提取游离态酚类所得水相中加入10 mL 4 mol/L NaOH 溶液，充入氮气后封口，室温振荡反应4 h，加6 mol/L HCl 将pH 值调至2，酯键合态酚类萃取过程同上。

糖苷键合态：将提取完酯键合态酚类所得水相进行糖苷键合态提取，与4 mL HCl 混匀进行水解提取，水解温度85 ℃，时间30 min，糖苷键合态酚类萃取方法同上。

1.3.2 酚酸含量测定[21-22]采用Folin-Ciocalten法进行酚酸含量的测定，用96 孔板进行试验，标准品为没食子酸（Gallic acid），由没食子酸系列标准溶液制作标准曲线。25 μL 样品或标准品溶液中加125 μL 福林酚试剂（0.2 mol/L），室温下反应10 min，再加饱和Na2CO3溶液（10 g/100 mL）125 μL 反应30 min，样品或标准品溶液加反应液后在振荡器上缓慢摇匀，测定其在波长765 nm 下的吸光度值，样品所测含量以mg/g DW 表示。

1.3.3 黄酮含量测定[21-22]采用亚硝酸钠-三氯化铝法进行黄酮含量测定，用96 孔板进行试验，标准品为儿茶素（Catechin），由儿茶素系列标准浓度制作标准曲线。25 μL 样品或标准品溶液与110 μL NaNO2（0.066 mol/L）于室温混合反应5 min，加入15 μL 的AlCl3（0.75 mol/L）溶液反应6 min，最后加入100 μL NaOH（0.5 mol/L）溶液反应10 min，样品或标准品溶液加反应液后在振荡器上缓慢摇匀，测定其在波长510 nm 下的吸光度值，样品所测含量以mg/g DW 表示。

1.3.4 亚铁离子还原能力（FRAP）测定[22-23]FRAP工作液：TPTZ 溶液（10 mmol/L）、醋酸钠缓冲溶液（0.3 mol/L）和三氯化铁溶液（20 mmol/L）按1∶10∶1 的体积比进行混合，工作液现用现配。

方法：预热至37 ℃的FRAP 工作液180 μL加10 μL 样品或FeSO4标品溶液，混匀后37 ℃避光反应10 min，测定其在波长593 nm 下的吸光度值，以FeSO4为标准对照，抗氧化活性测定结果以mmol Fe2+/g DW 表示。

1.3.5 DPPH 自由基清除能力测定[22-23]100 μL DPPH 甲醇溶液（0.065 mmol/L）和100 μL 样品或空白溶液混匀后室温避光反应30 min，测定其在波长517 nm 下的吸光度值，以Trolox 为标准对照，样品DPPH 清除能力以mg TE/g DW（TE，Trolox equivalent）表示。清除率按公式（1）计算。

式中，Ai——DPPH 工作液加样品溶液所测吸光度值；Aj——甲醇加样品溶液所测吸光度值；Ac——样品溶剂加DPPH 工作液所测吸光度值。

1.3.6 ABTS 自由基清除能力[23-24]ABTS 工作液：取7.0 mmol/L ABTS 储备液5 mL，添加88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液后混匀，静置12～16 h。用80%的甲醇溶液稀释ABTS 工作液，使稀释后溶液在波长734 nm 处的吸光值为0.7±0.02。

方法：20 μL 样品或标品溶液加200 μL ABTS 工作液，混匀后室温避光反应6 min，测定其在波长734 nm 下的吸光度值，以Trolox 为标准对照，样品ABTS 清除能力以mg TE/g DW（TE，Trolox equivalent）表示。清除率按公式（2）计算。

式中，A0——ABTS 工作液加样品溶剂所测吸光度值；Ai——ABTS 工作液加样品溶液所测吸光度值；Aj——80%甲醇加样品溶液所测吸光度值。

1.4 UPLC-QTOF-MS 定性分析[25-26]

液相条件如下，色谱柱：C18 色谱柱（Agilent eclipse plus，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速：0.3 mL/min，流动相：甲醇溶液（A）和含0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0～10 min，95%-90%A；10～30 min，90%-70%A；30～38 min，70%-50%A；38～43 min，50%A；43～45 min，50%-95%A。DAD：280 nm，进样量：5 μL，柱温：35 ℃。

质谱条件：全扫描模式：负离子，干燥气温度：300 ℃，离子源：电喷雾离子源，全质谱数据的质量范围：m/z 50～1 000，裂解电压：175 V，毛细管电压：3.5 kV，雾化气压力：30 psi，母离子的MS2 碰撞能：10～40 V，干燥气流速：10.0 L/min。

1.5 HPLC-QQQ-MS 定量分析[25-26]

液相条件：色谱柱：C18 色谱柱（Agilent eclipse plus，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速：0.3 mL/min，进样量：5 μL，柱温：35 ℃。流动相：甲醇溶液（A）和含0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0～18 min，95%-50%A；18～25 min，50%-5%A；25～28 min，5%-95%A。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源，质谱MRM多反应监测模式：负离子。

1.6 数据处理

试验结果均以平均值±标准差（mean±SD，n=3）表示。试验数据的分析软件为SPSS，方差分析用于显著性研究，统计学差异显著的指标为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 含量分析

鹰嘴豆提取物中酚酸及黄酮含量见表1，不同存在形式酚类物质的酚酸、黄酮含量不同，其中糖苷键合态酚类物质的酚酸含量最高，可达0.81 mg/g，而黄酮含量最低，为0.14 mg/g；游离酚类物质黄酮含量最高（0.26 mg/g），酚酸含量最低（0.16 mg/g）；酯键合态酚类物质的酚酸、黄酮含量分别为0.32 mg/g 和0.18 mg/g。Xu 等[27]采用有机溶剂提取鹰嘴豆酚酸含量为1.41～1.81 mg/g、黄酮含量为0.18～3.16 mg/g。Xu 等[28]所测鹰嘴豆酚酸、黄酮含量分别为0.98 mg/g，0.72 mg/g。Han 等[29]所测鹰嘴豆酚酸含量为2.2 mg/g，高于本研究结果；而Fernandez-Orozco 等[30]所测酚酸含量为0.54 mg/g，低于本研究结果。研究时所用的原料提取方法、原料品种、生长区域及环境、选取标准、对照种类等因素都有可能造成研究结果的差异。

表1 提取物含量及抗氧化能力测定Table 1 Determination of extracts content and antioxidant activity

2.2 抗氧化能力分析

鹰嘴豆酚类提取物的抗氧化能力如表1 所示，不同存在形式酚类提取物的抗氧化能力差异显著，其中糖苷键合态提取物具有最高的FRAP还原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力，其值分别为36.66 mmol Fe2+/g，1.20 mg TE/g，0.93 mg TE/g；游离态提取物具有最低的FRAP 还原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力，其值分别为2.61 mmol Fe2+/g，0.27 mg TE/g，0.22 mg TE/g。Han 等[28]研究表明，有机溶剂所提鹰嘴豆ABTS 清除能力为1.5 μmol TEAC/g，而Nithiyanantham等[31]采用不同溶剂提取鹰嘴豆酚类物质，其FRAP值为758.88～1517.57 mmol Fe（Ⅱ）/μg 提取物，赵艳等[32]所测FRAP 值为45.02～53.38 μmol/g。提取方法、提取所得物质酚类种类及含量不同，原料品种、采收时间及栽培地区等因素都有可能造成研究结果的差异。

2.3 定性分析

80%甲醇提取物中物质初步分析鉴定使用UPLC-QTOF-MS，主要依据指标为样品及标准品的质谱分子离子峰及离子碎片数据、UV 吸收光谱、出峰时间等信息，结合数据库（Metlin）和参考文献等信息。图1 所示总离子流图（Total ion current，TIC），鉴定结果见表2，初步鉴定出24 种化合物，包括4 种酚酸、12 种黄酮。

Zhao 等[33]通过IR 及NMR 等技术鉴定出鹰嘴豆乙醇提取物中含有鹰嘴豆芽素A、红车轴草根苷、毛蕊异黄酮、印度黄檀苷、芒柄花素、染料木素、芒柄花苷等7 种异黄酮；Sreerama 等[34]从鹰嘴豆提取物中鉴定出黄豆苷元、对羟基苯甲酸、绿原酸、槲皮素、染料木素、香草酸、阿魏酸、杨梅素、原儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、山奈酚、没食子酸、丁香酸、芥子酸等15 种酚类物质；Magalhães 等[35]从鹰嘴豆提取物中鉴定得到槲皮素-3-O-鼠李糖苷、丁香酸、木犀草素-8-O-葡糖苷、对羟基苯甲酸、杨梅素-3-O-鼠李糖苷、龙胆酸、槲皮素-3-O-半乳糖苷等7 种酚类物质；Konar 等[36]鉴定出芒柄花苷、染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷、印度黄檀苷、鹰嘴豆芽素A、黄豆黄素、染料木素、芒柄花素、黄豆苷元等10 种酚类物质。本试验在鹰嘴豆80%甲醇提取物中新鉴定出牡荆素、虎杖苷、异鼠李素-O-葡糖苷酸、芦丁等4 种酚类物质。

图1 80%提取液总离子流图Fig.1 TIC of 80% methanol extract

2.4 定量分析

采用HPLC-QQQ-MS 对鹰嘴豆80%甲醇提取物中酚类物质进行定量分析[37]，条件如表3 所示，标准品的标准曲线由外标法测得。

定量测定鹰嘴豆80%甲醇提取物中的9 种酚类物质，可以看到，对羟基苯甲酸、香豆酸、原儿茶酸类物质含量最高，分别为（10.26±0.50），（2.30±0.04），（2.67±0.10）μg/g，黄豆苷、芦丁、槲皮素，而染料木苷、黄豆黄苷、牡荆素含量最低，分别为（0.13±0.01），（0.08±0.01），（0.07±0.01）μg/g。Konar 等[36]对鹰嘴豆提取物进行定量分析，测得鹰嘴豆芽素A、黄豆苷元、芒柄花素、染料木素、黄豆黄素、印度黄檀苷、黄豆苷、芒柄花苷、染料木苷、黄豆黄苷含量分别为0.846，0.009，0.08，0.012，0.772，1.016，0.014，0.056，0.05，0.221 μg/g；Magalhães等[35]从鹰嘴豆提取物中测得对羟基苯甲酸、丁香酸、龙胆酸、木犀草素-8-O-葡糖苷、杨梅素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量分别为19.2～60.5，45.9，8.1～26.0，1.2，7.4，5.0，7.2 μg/g；Fratianni 等[38]所测鹰嘴豆提取物中没食子酸、绿原酸、儿茶素、槲皮素、阿魏酸、木犀草素、香豆酸含量分别为5.42～6.2，4.62～7.37，147.79～178.21，0.37～3.17，5.03～8.37，0.55，0.43 μg/g。本研究与所报道文献所测单体酚类含量有所不同，可能是因为原料品种、原料颜色、提取方法及定量分析方法等存在差异。

3 结论

本试验用有机溶剂提取鹰嘴豆中可溶性酚类，并对其中以不同键合态存在的物质进行分离，结果表明，以糖苷键存在的酚酸含量可达0.81 mg/g，相比于其它键合态含量最高；游离态酚酸含量最低，黄酮含量最高。糖苷键合态提取物具有最高的FRAP 还原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力，其值分别为36.66 mmol Fe2+/g，1.20 mg TE/g，0.93 mg TE/g；而游离态提取物具有最低的FRAP 还原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力。本试验采用液相-质谱联用仪对鹰嘴豆提取物进行定性分析，80%甲醇提取物中共鉴定出24 种物质，其中黄酮类物质有12 种、酚酸有4 种；对所鉴定物质中的9 种酚类物质进行定量研究，结果显示鹰嘴豆中对羟基苯甲酸、原儿茶酸、香豆酸类化合物含量丰富。本研究可为鹰嘴豆的进一步开发及产业化利用提供科学数据。