不同培养体系对金华猪卵母细胞体外成熟的影响

屠平光，范雅婷2，黄剑锋，项 云，楼芳芳，章啸君

(1.金华市农业科学研究院，浙江 金华 321007； 2.金华广福医院)

卵母细胞体外成熟是胚胎工程和发育生物学的重要组成部分，是胚胎体外生产上游环节，其成熟率的高底和质量的优劣很大程度上决定了后期的结果，是体外胚胎生产技术以及体细胞核移植生产核移植动物技术的重要环节，因此获得具有较强发育能力的卵母细胞是各种后续相关胚胎生物技术的前提和关键点。目前，体外获得的卵母细胞无论是成熟还是受精后支持发育的能力都比体内差，说明体外成熟培养环境还远未达到体内的生理水平[1]。Sun等[2]归因于培养基缺陷致胞质成熟不充分。本实验通过比较不同培养体系对金华猪卵母细胞的成熟率，建立金华猪卵母细胞比较理想的体外成熟培养体系，为后期开展核移植、体外胚胎构建等实验提供足量、优质的成熟卵母细胞。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 本试验中所用试剂除特别指明外,均购自Sigma公司。FSH和LH购自宁波激素厂，猪卵泡液(PFF)、发情猪血清实验室自制。体视显微镜(Olympus TRPT-4045型)；CO2培养箱(Thermo 311)；倒置显微镜(Olympus-CKX41)；超净工作台(苏州，SW-CJ-IB型)。

1.2金华猪卵巢采集 试验所用猪卵巢采自金华屠宰场。在猪屠宰后20～30 min内取出卵巢，立即无菌采集卵巢，用解剖剪切除子宫及卵巢上多余的脂肪组织后，放入盛有1000 mL含双抗的灭菌生理盐水中，初始控制温度38℃，1 h内带回实验室。

1.3金华猪卵泡卵母细胞的采集与体外成熟培养 采用抽吸法采集卵母细胞，用灭菌生理盐水将卵巢清洗3次后，吸干卵巢表面的水珠，用带有12号针头的10 mL注射器抽取卵巢表面直径为3～8 mm卵泡中的卵母细胞。将抽取物缓慢注入35 mm的拣卵皿中，静置沉淀5～10 min后，于体视镜下拣取形态正常，胞质均匀，卵外有3～6层颗粒细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用成熟培养液洗涤3次，然后移入已在CO2培养箱平衡2 h的50 μL的成熟培养微滴中，上盖石蜡油，每个微滴培养卵母细胞10～20枚。培养条件为38.5℃，100%饱和湿度和5%CO2进行体外成熟培养(IVM)。

1.4试验设计 卵母细胞体外成熟培养时,按培养液体系的不同分为4组：试验组1为TCM199基础培养液；试验组2为TCM199基础培养液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH；试验组3为TCM199基础培养液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10% PFF(卵泡液)；试验组4为TCM199基础培养液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10% PFF+10%血清(发情金华猪血清/胎牛血清)；四种培养体系分别进行卵母细胞体外成熟培养，观察卵母细胞体外成熟情况，以探讨不同培养体系对金华猪卵母细胞体外成熟的影响，试验重复3次。

1.5卵母细胞体外成熟的判断 卵母细胞成熟培养44 h后，将卵母细胞(COCs)放入含0.1%的透明质酸酶的成熟液中3 min，用仅仅比卵母细胞大几个微米的吸管将卵母细胞反复吸入吹出，以去除卵丘细胞。在实体显微镜下观察第一极体是否存在，以第一极体排出作为卵母细胞成熟的标准。

1.6数据分析 用Graphpad Prism 5软件，对试验数据进行单因素方差分析。

2 结果

2.1培养体系对金华猪卵母细胞体外成熟影响 由表1可见，试验组4培养体系在金华猪卵母细胞成熟率最高；试验组2和3之间成熟率差异不显著(P>0.05)；添加性腺激素的试验组2、3和4的成熟率显著高于不添加性腺激素的试验组1(P<0.05)。

表1 不同培养体系对金华猪卵母细胞

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

2.2血清对金华猪卵母细胞成熟影响 结果如表2可知，在成熟液中分别加入10%的发情金华猪血清，10%的胎牛血清，其它成分相同，COCs在2种成熟培养液中培养后的成熟率分别为76.4±2.1，75.8±1.9，两组之间卵母细胞的成熟率没有显著差异(P<0.05)。

表2 不同类型血清对金华猪卵母细胞成熟影响

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

猪卵母细胞体外成熟培养基种类很多，TCM199是当前应用最广的基础培养基之一[3]，大多数研究者认为在卵母细胞的体外成熟培养中，添加激素FSH和LH，卵泡液PFF以及血清是常用的成份。Goto[4]等认为，血清中存在激素对卵母细胞的核质成熟起重要作用。激素是哺乳动物卵母细胞成熟的重要物质，它们在体内调节卵母细胞成熟的作用机理已比较清楚。目前，在动物卵母细胞的体外成熟培养体系中，通常使用商业化的胎牛血清[5]。本试验在金华猪卵母细胞体外成熟培养体系中，添加发情金华猪血清同样能够提高卵母细胞的体外成熟率，实验结果说明胎牛血清和发情金华猪血清对金华猪卵母细胞的核成熟效果一致，都可起到促进作用。说明在金华猪卵母细胞体外成熟中添加一定量的血清是必需的，相对于其它动物而言，发情猪血清较容易获取，一次可采集的量较大，且容易制备，并且发情金华猪血清在促进金华猪卵母细胞的体外成熟具有同源性，可用自制价钱低廉的发情金华猪血清代替昂贵的胎牛血清用于猪卵母细胞体外成熟培养体系中。

本实验共进行了4组不同培养体系试验，结果表明，试验组4采用TCM199作为体外成熟基础培养液，添加10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黄体素(LH)、10%卵泡液(PFF)、10%血清，在成熟率上均显著高于其他试验组(P<0.05)，但添加10%发情金华猪血清或10%胎牛血清，在卵母细胞的成熟率方面两者无显著差异(P>0.05)。说明FSH、LH、PFF以及血清组合添加应用可以提高金华猪卵母细胞的成熟率。