黑顺片质量标准研究

朱欢　蒙春旺　熊亮　朱雅宁　唐莉　郝莉　彭成　周勤梅

摘要：目的  完善黑順片质量评价方法，为其质量监控提供参考。方法  采用薄层色谱法对不同产地黑顺片进行定性鉴别;参照2015年版《中华人民共和国药典》通则方法测定黑顺片的水分、灰分、浸出物及农药残留;采用滴定法对黑顺片的钙离子含量进行测定。结果  不同产地黑顺片薄层色谱斑点清晰，分离度好;拟定黑顺片中水分不得过14.0%，总灰分不得过6.0%，酸不溶灰分不得过1.0%，水溶性浸出物不得少于8.0%，钙离子含量为130～280 μmol/g;11批四川江油黑顺片均未检出9种有机氯类农药残留。结论  本研究建立的方法专属性强，操作简单，重复性好，可为黑顺片的质量评价提供依据。

关键词：黑顺片;质量标准;薄层色谱法;浸出物

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）03-0061-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905017

Study on Quality Standards of Heishunpian

ZHU Huan1， MENG Chunwang1， XIONG Liang1， ZHU Yaning2， TANG Li2， HAO Li2， PENG Cheng1， ZHOU Qinmei1

1. Pharmacy College， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， The State Key Laboratory of charactenistic Chinese Medicine Resources in Southwest China， Chengdu 611137， China; 2. Ya'an Sanjiu Pharmaceutical Co.， Ltd.， Ya'an 625000， China

Abstract： Objective To optimize a quality evaluation method for Heishunpian; To provide references for the quality control of Heishunpian. Methods Heishunpian from different producing areas were examined by TLC for qualitative identification. According to Pharmacopoeia of People's Republic of China （2015 version）， the moisture， ash content， extraction and pesticide residues of Heishunpian were determined; The content of calcium ion of Heishunpian was determined by titration. Results The spots of Heishunpian from different producing areas were clear and the separation degree was good. The contents of moisture ≤14.0%， total ash ≤6.0%， acid-insoluble ash ≤1.0%， water-soluble extract ≥8.0% and the content of calcium ion should be 130–280 μmol/g. Nine organochlorine pesticides were not detected in 11 batches of Heishunpian from Jiangyou in Sichuan Province. Conclusion The method established in this study is specific， simple and reliable， which can provide a basis for the quality standards of Heishunpian.

Keywords： Heishunpian; quality standards; TLC; soluble extract

黑顺片为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品[1]，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛功效，临床应用广泛，既是目前市场主要流通品种，也是金匮肾气丸等传统中成药的重要原材料，其质量优劣对相关中成药的安全性和有效性有重要影响。目前业内以2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）为黑顺片质控标准，主要包括薄层鉴别、水分、双酯型生物碱限量、含量测定。其地方标准主要收录于各省市中药材/中药饮片炮制规范[2-3]，内容多以炮制工艺为主。但药典及地方标准中均未见黑顺片灰分、浸出物、农药残留、钙离子含量等内容，其相关项目有待完善和提高。

本试验通过优化薄层鉴别条件，以区分不同产地黑顺片及其他炮制品。在常规检查项中，针对黑顺片在采收加工过程中常会粘附或夹杂有尘土、泥沙，炮制加工时对胆巴漂洗不充分会导致钙离子含量增加，以及水分过高可能发生霉变等问题，为保证黑顺片饮片质量稳定可靠，本试验在《中国药典》基础上增加了灰分检查项、钙离子含量，并提高了水分标准。在安全检查项中，针对黑顺片原药材种植栽培过程中常使用农药防治病虫等问题，为保证药材安全性，本试验对其农药残留进行测定。另外，黑顺片主要以水煎入药，其水溶性生物碱具有显著的强心[4-5]、抗心律失常和降压等作用[6-7]，通过增加水溶性浸出物测定，为初步衡量黑顺片质量优劣提供依据。本试验对3个产地共35批黑顺片及15批不同类型附子炮制品开展质量研究，为黑顺片的质量标准完善提供参考。

1  仪器与试药

岛津GC-2010Plus气相色谱仪（岛津公司），63Ni-ECD电子捕获检测器（岛津公司），KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣仪器生化厂），TDZ5-WS台式低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），MiLi-Q纯水器（Direct 8，美国Milipore公司），202-00型干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司），DLD-30程控煅药炉（杭州海善制药设备有限公司），ZDHW型调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），HX-200高速中药粉碎机（浙江永康市溪岸五金药具厂），Sartorius系列电子分析天平（BP221S，德国赛多利斯公司），药典2号筛、4号筛（道墟化验仪器设备厂），定量滤纸（抚顺市民政滤纸厂），电陶炉（康佳KES- W21CS323）。

對照品新乌头碱（批号110799-200404）、次乌头碱（批号110798-200404），中国食品药品检定研究院;对照品乌头碱（批号MUST-17022206）、苯甲酰次乌头原碱（批号MUST-15010806）、苯甲酰乌头原碱（批号MUST-15012215）、苯甲酰新乌头原碱（批号MUST-15012216），成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%;附子灵、尼奥灵、宋果灵，本课题组自制，纯度均大于98%。六六六、滴滴涕溶液（农业部环境保护科研监测所，批号201802），五氯硝基苯（农业部环境保护科研监测所，批号201705）。无水硫酸钠、乙醚、正己烷、氯化钠、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、甲醇、异丙醇、丙酮、硫酸、硝酸银、二乙胺、氨水均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂），高氯酸（上海桃浦化工厂），硝酸（四川德阳化学试剂厂），乙二胺四醋酸二钠、钙紫红素指示剂、氢氧化钠、三乙醇胺（成都市科隆化学品有限公司），盐酸（西陇科学有限公司，批号180201）。

35批黑顺片，其中四川江油11批、云南12批、四川布拖12批，均由四川江油中坝附子科技发展有限公司参照2015年版《中国药典》（一部）炮制加工而成，见表1。另收集4种附子炮制品饮片15批，来源信息见表2。所有样品均经成都中医药大学高继海副教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品。

2  方法与结果

2.1  薄层鉴别

2.1.1  溶液制备

取对照品乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，以及附子灵、尼奥灵、宋果灵自制对照品适量，精密称定，各加异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液，制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，即得对照品溶液。

取黑顺片及其余4种炮制品粉末各2 g，加氨试液3 mL润湿，加乙醚25 mL，超声处理30 min，过滤，滤液挥干，残渣加二氯甲烷0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2  条件筛选

将黑顺片供试品溶液，对照品乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱及自制对照品（附子灵、宋果灵、多根乌头碱、尼奥灵）进行展开。发现黑顺片在苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱对应位置上有明显斑点，而在乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品及附子灵、尼奥灵、多根乌头碱、宋果灵的对应位置上无明显斑点，因而确定薄层色谱鉴别的对照品为苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱。

采用2015年版《中国药典》黑顺片项下薄层鉴别展开比例[1]对比自制硅胶G板、默克板、预制硅胶G板的薄层鉴别效果。发现自制硅胶G板的分离效果较差，但显色后斑点保留时间较长;默克板的分离效果较好，而显色后斑点保留时间较短，不便于观察和记录;预制硅胶G板的分离效果较好，且显色后斑点保留时间相对较长，确定为最优薄层板。

对不同展开体系（正己烷-乙酸乙酯-甲醇、正己烷-乙酸乙酯-丙酮-二乙胺、正己烷-二氯甲烷-丙酮-二乙胺、二氯甲烷-丙酮-二乙胺、二氯甲烷-甲醇-二乙胺、乙酸乙酯-丙酮-二乙胺、乙酸乙酯-甲醇-二乙胺、二氯甲烷-甲醇-氨水等）、不同展开比例（二氯甲烷-甲醇-氨水=16∶2∶0.1、10∶1∶0.1、8∶1∶0.1）及展开剂中不同氨水比例（二氯甲烷-甲醇-氨水=16∶2∶0.1、16∶2∶0.15、16∶2∶0.2、16∶2∶0.25）进行考察，结果表明二氯甲烷-甲醇-氨水=16∶2∶0.15的展开效果最优，确定为最优展开条件。

最终确定薄层鉴别最佳条件为：参照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，吸取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱对照品溶液及供试品溶液各5～10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-氨水（16∶2∶0.15）为展开剂，在展开缸中饱和40 min，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液显色。

2.1.3  鉴别结果

采用上述方法对35批黑顺片及其余4种炮制品进行薄层鉴别分析，发现样品中生物碱成点性好，分离度佳。11批四川江油黑顺片在3个对照品对应位置上均有明显的显色斑点;12批云南黑顺片和12批四川布拖黑顺片在苯甲酰新乌头原碱的对应位置上有明显显色，苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱显色较弱。淡附片与黑顺片的薄层色谱情况最为相似，但黑顺片中单酯型生物碱显色更为明显，炮附片苯甲酰乌头原碱显色较黑顺片弱;盐附子和白附片的薄层图谱中未见单酯型生物碱的斑点。见图1～图4。

2.2  水分、总灰分、酸不溶灰分及水溶性浸出物检查及钙离子含量测定

参照2015年版《中国药典》四部通则0832水分测定法第二法（烘干法）、2302灰分测定法、2201热浸法对35批黑顺片的水分、总灰分、酸不溶灰分及水溶性浸出物进行考察。

采用滴定法[9]测定钙离子含量。精密称取黑顺片粉末（过4号筛）0.5 g，加硝酸-高氯酸（4∶1）混合溶液10 mL，缓慢加热消解，保持微沸，持续加热至冒浓烟，直至白烟散尽，挥干。如未消解完全，重复加入硝酸-高氯酸（4∶1）混合溶液10 mL，直至消解完全。加5%盐酸溶液5 mL溶解，加水50 mL，加入15 mL氢氧化钠试液，加30%三乙醇胺2 mL，摇匀，再加适量钙紫红素指示剂，用0.01 mol/L乙二胺四醋酸二钠滴定液滴定至溶液由紫红色轉变为纯蓝色，每1 mL乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.01 mol/L）相当于10 ?mol钙。

由表3可以看出，35批黑顺片水分含量为8.83%～12.20%，四川江油、布拖及云南黑顺片的水分均值分别为11.41%、10.37%、9.91%;35批黑顺片总灰分及酸不溶灰分为2.08%～4.27%、0.06%～0.51%，四川江油、布拖及云南黑顺片的总灰分均值分别为2.34%、3.44%、3.55%，酸不溶灰分均值分别为0.20%、0.30%、0.13%;35批黑顺片水溶性浸出物为8.57%～35.83%，四川江油、布拖及云南黑顺片的水溶性浸出物均值分别为12.57%、29.03%、31.23%。参考2015年版《中国药典》及相关标准，结合测定结果，拟定黑顺片中水分不得过14.0%，水溶性浸出物不得少于8.0%。鉴于黑顺片在炮制加工方法与黄附片较为相似，均为胆巴浸数日-煮至透心-捞出（剥皮）-切片浸漂-调色-蒸至透心，出现油面光泽再烘干，其中黄附片捞出后需剥皮，而黑顺片不剥皮，因此，参考《四川省中药饮片炮制规范（2015年版）》对黄附片总灰分及酸不溶灰分的限定[8]并结合本试验数据，规定黑顺片总灰分不得过6.0%，酸不溶性灰分不得过1.0%。

35批黑顺片钙离子含量为114.68～303.89 μmol/g，四川江油、布拖及云南黑顺片钙离子含量均值分别为168.22、202.12、230 μmol/g。鉴于3个产地黑顺片均为同一企业采用相同方法炮制而成，从测定结果来看，产地不同对黑顺片钙离子含量有明显影响，故按均值上下浮动20%计算，建议黑顺片中钙离子含量为130～280 μmol/g。

2.3  有机氯农药残留测定

2.3.1  溶液制备

取六六六、滴滴涕溶液各0.50 mL，用正己烷定容至5 mL，得5 ?g/mL标准贮备液。取标准贮备液1.0 mL，用正己烷定容至10 mL，得0.5 ?g/mL标准溶液。分别取0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mL标准溶液定容至10 mL，即得六六六（α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH）和滴滴涕（p，p-DDE、p，p-DDD、o，p-DDT、p，p-DDT）标准品溶液。

取五氯硝基苯液1.0 mL，用正己烷定容至5 mL，得20 ?g/mL标准贮备液。取标准贮备液1.0 mL，用正己烷定容至10 mL，得2 ?g/mL溶液。取2 ?g/mL溶液2.5 mL，用正己烷定容至10 mL，得500 ?g/L标准溶液。分别取标准溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mL，定容至10 mL，即得五氯硝基苯标准品溶液。

参照2015年版《中国药典》四部通则2341农药残留量测定法农药残留测定法第一法（9种有机氯类农药残留量测定法）制备黑顺片供试品溶液。

2.3.2  线性关系考察

吸取上述标准品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，参照2015年版《中国药典》四部通则2341农药残留量测定法农药残留测定法第一法（9种有机氯类农药残留量测定法）色谱条件测定，以峰面积（mAU）为横坐标，进样量（μg）为纵坐标，进行线性回归，线性关系考察结果见表4，色谱图见图5。

2.3.3  样品测定

取供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，HSP-1气相色谱图见图6。结果11批四川江油黑顺片均未检出9种有机氯类农药。

3  讨论

附子生品有大毒，其毒性成分双酯型生物碱经炮制加工后可转化为毒性较小的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱等单酯型生物碱[10-11]，但由于附子产地及炮制方法不同，使其炮制品中生物碱成分具有差异[12]。陈苡然等[13]对10批黑顺片进行了薄层色谱鉴定，尚未涉及不同产地黑顺片及附子不同炮制品的快速鉴定区分。本试验对3个产地共35批黑顺片、15批附子不同炮制品进行薄层鉴别，能明显区分不同产地黑顺片并辨别不同炮制品种。四川布拖和云南黑顺片薄层检识苯甲酰新乌头原碱显色明显，但在苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱位置几乎无显色，四川江油黑顺片的3个单酯型生物碱均能被检识，能快速、灵敏地反映产地差异，故薄层鉴别对于区别不同产地黑顺片有一定意义;同时发现四川江油黑顺片与淡附片、炮附片、盐附子和白附片的薄层色谱有差异，故薄层色谱法对区分四川江油黑顺片与盐附子、白附片和炮附片有一定意义。本试验通过优化黑顺片薄层色谱鉴别方法，可为不同产地黑顺片及附子不同炮制品种的鉴别提供一定依据。

目前有关黑顺片水分、灰分、钙离子含量、农药残留及水溶性浸出物等内容报道较少，而此类常规检查、安全性检查在黑顺片质量控制中极为重要。陈苡然[14]对20批不同等级黑顺片的水分、灰分及水溶性浸出物进行比较，但并未对其限量;黄慧莲等[15]测定了22批黑顺片的水分、灰分及醇浸出物，规定水分不得过14.0%，总灰分不得过10.0%，酸不溶灰分不得过1.0%，醇浸出物不低于7.0%。本试验较之增加了黑顺片样品批次，且各产地批次更均衡;水分的限定较2015年版《中国药典》有所提升;参考《四川省中药饮片炮制规范（2015年版）》[8]黄附片总灰分限定并结合试验数据，拟定总灰分不得过6.0%，较文献[15]规定的总灰分不得过10.0%有所提升，这一差异可能由不同厂家的黑顺片炮制工艺不同或药材本身质量所致。

通过对不同产地黑顺片样品薄层鉴别、水分、灰分、酸不溶灰分、水溶性浸出物、钙离子含量及有机氯农药残留进行测定，本研究拟定黑顺片中水分不得过14.0%，总灰分不得过6.0%，酸不溶灰分不得过1.0%，水溶性浸出物不低于8.0%，钙离子含量为130～280 μmol/g，并建议有机氯农药残留不纳入黑顺片质量标准草案。

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（收稿日期：2019-05-06）

（修回日期：2019-06-01;编辑：陈静）