基于Morris水迷宫的小鼠学习记忆规律研究

赵 瑛，高伟莹，余群星，王冬雪，刘 冰

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)是用于研究啮齿类动物学习记忆的经典行为学实验方法[1].在用于学习记忆机制[2]、药物对学习记忆的改善[3-4]、评价疾病模型等[5-9]研究时，实验学者多采用测试期的逃避潜伏期平均数差别是否具有统计学意义来评价模型是否成功或药物是否起到作用，而缺乏实验过程中小鼠学习规律的系统性研究与评价.且不同实验室对实验动物每天训练次数及总训练时程各不同一，使得在进行各实验室实验结果对比和评价时，会影响各实验结果间的比较和实验参考价值，使实验质量和实验效率降低.基于目前水迷宫实验存在的问题，本实验采用文献报道较多的每天训练2次、3次两种不同的训练方式，考察不同训练方式对小鼠学习记忆成绩的影响，分析实验过程中小鼠学习成绩变化规律，并得出不同训练方式下小鼠的最佳训练时程.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

ICR小鼠，雌雄各半，体重为(20±2)g，4～5周龄，SPF级.由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供(许可号为SCXK(吉)-2011-0004；长春，中国).3批次合格证号分别为：20141302；201411413；20143617.将室温控制在(23±2)℃的范围内，相对湿度45%～55%，动物自由饮水摄食.实验动物饲养和实验过程中做到实验动物使用的3R原则，并给予实验动物人道关怀.

3批ICR小鼠，适应性饲养7 d，按体重性别随机分为2 次/d组(每天训练2次)和3 次/d组(每天训练3次).第1批2 次/d组(n=17)、3 次/d组(n=20)；第2批2 次/d组(n=17)、3 次/d组(n=21)；第3批2 次/d组(n=47)、3 次/d组(n=30).

1.1.2 实验设备

MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统，购自成都泰盟科技有限公司.包括MT-200 Morris水迷宫：水迷宫圆形水池(D=120 cm，h=30 cm)；平台(D=8 cm，h=15 cm).

1.1.3 实验试剂

二氧化钛：购自天津多福源实业有限公司，产品标准号：Q/12JH4152；染色用苦味酸(2，4，6-三硝基酚)：购自汕头市西陇化工厂有限公司.

1.2 方法

1.2.1 适应性训练

正式实验前一天，不放置平台，让小鼠自由游泳120 s.训练完毕后立即取出小鼠并擦干以避免应激反应.

1.2.2 定位航行实验

实验前，将不同标记物分别贴在4个象限.平台在水面以下1 cm处，水温控制在(20.0±2)℃，并用二氧化钛将水染成乳白色.实验时将小鼠在除目标象限(平台所在象限)之外的三个象限随机面对池壁放入水中，当小鼠找到平台后，记录潜伏期，并在平台上停留30 s；如果小鼠在120 s内未找到平台，潜伏期记为120 s，并引导小鼠在平台上停留30 s，让其根据四个象限的参照物进行空间学习记忆.每次训练完成后将小鼠立即取出并擦干以避免应激反应.记录小鼠的游泳速度，逃避潜伏期、外环滞留时间百分比，目标象限滞留时间百分比等指标.

2 次/d组于每天10 点、14 点对实验小鼠进行定位航行实验；3 次/d组于每天8 点、12 点、16 点对实验小鼠进行定位航行实验.

1.3 统计学方法

通过SPSS 19.0统计软件进行数据处理，当符合正态分布时，两组比较采用独立样本t检验；组内三批次间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布时，则采用秩和检验.以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 实验结果

2.1 游泳速度变化

2.1.1 组内游泳速度比较

同一训练次数下，2 次/d组和3 次/d组不同批次小鼠间的游泳速度比较均无统计学差异(P>0.05)，见图1、2.

2.1.2 两组游泳速度比较

由于每组不同批次小鼠之间的游泳速度无统计学差异，因此将每组的三批实验数据分别合并为大数据进行统计分析.同一训练次数下，2 次/d、3 次/d组小鼠游泳速度比较无统计学差异(P>0.05).说明两组小鼠的体力没有差别，并且随着训练次数的增加小鼠的游泳速度也无明显的变化，见图3.

图1 2 次/d组3批小鼠游泳速度

图2 3 次/d组3批小鼠游泳速度

图3 2 次/d组与3 次/d组游泳速度

2.2 外环滞留时间百分比比较

2.2.1 组内外环滞留时间百分比比较

同一训练次数下，2 次/d组和3 次/d组不同批次小鼠间的外环滞留时间百分比比较均无统计学差异(P>0.05)，如图4、5.

图4 2 次/d组3批小鼠外环滞留时间百分比

图5 3 次/d组3批小鼠外环滞留时间百分比

2.2.2 两组外环滞留时间百分比比较

由于两组不同批次小鼠间的外环滞留时间百分比无统计学差异，因此分别将每组的三批实验数据合并成大数据进行统计分析.同一训练次数下，2 次/d、3 次/d组小鼠的外环滞留时间百分比比较无统计学差异(P>0.05).与自身第1次外环滞留时间百分比相比，2 次/d组和3 次/d组小鼠分别在第3次和第4次开始出现统计学差异(P<0.05)，并分别从第3次和第4次开始趋于稳定，见图6.

2.3 目标象限滞留时间百分比比较

2.3.1 组内目标象限滞留时间百分比比较

同一训练次数下，2 次/d组和3 次/d组不同批次小鼠间的目标象限滞留时间百分比比较均无统计学差异(P>0.05)，见图7、8.

注：2 次/d组n=81，与第1次比较：*P<0.05；3 次/d组n=71，与第1次比较：△P<0.05

图6 2 次/d组与3 次/d组外环滞留时间百分比

图7 2 次/d组3批小鼠目标象限滞留时间百分比

图8 3 次/d组3批小鼠目标象限滞留时间百分比

2.3.2 两组目标象限滞留时间百分比比较

由于两组不同批次小鼠间目标象限滞留时间百分比无统计学差异，因此分别将两组的实验数据合并成大数据进行统计分析.与自身第1次训练目标象限滞留时间百分比相比，2 次/d组和3 次/d组均在第3次开始出现统计学差异(P<0.05).同一训练次数下两组比较，仅在第13次出现统计学差异(P<0.05)，其他训练次数两组总样本比较无统计学差异(P>0.05).见图9.

注：vs第1次训练：2 次/d组，*P<0.05；3 次/d组，△P<0.05；vs 2 次/d组：□P<0.05

图9 2 次/d组与3 次/d组目标象限滞留时间百分比

2.4 逃避潜伏期变化

2.4.1 组内逃避潜伏期比较

同一训练次数下，2 次/d组和3 次/d组不同批次小鼠间的逃避潜伏期比较无统计学差异(P>0.05)，见图10、11.

图10 2 次/d组3批小鼠逃避潜伏期

图11 3 次/d组3批小鼠逃避潜伏期

2.4.2 两组逃避潜伏期比较

由于2 次/d组和3 次/d组不同批次小鼠间逃避潜伏期无统计学差异，因此分别将两组实验数据合并成大数据进行统计分析.与自身第1次训练比较：2 次/d组和3 次/d组分别在第3次和第4次开始出现统计学差异(P<0.05).同一训练次数下两组比较均无统计学差异(P>0.05)，见图12.

注：2 次/d组n=81，与第1次比较：*P<0.05；3 次/d组n=71，与第1次比较：△P<0.05

图12 2 次/d组与3 次/d组逃避潜伏期

2.4.3 不同训练次数下的学习成绩提高率

为更准确描述小鼠学习成绩与训练次数之间的关系，设定t与t′分别为第(n-1)次与第n次训练时小鼠的逃避潜伏期，小鼠登录平台学习最长时限T=120 s，因此得出第n次训练时小鼠学习成绩提高率P=[(t-t′)/120]*100%.

对两组小鼠各次训练时其学习成绩提高率进行分别计算，如表1结果所示.通过对两组小鼠的学习成绩提高率进行分析可得，2 次/d组学习成绩提高率的最大差值在第3次与第4次训练间为25.2%；3 次/d组学习成绩提高率的最大差值在第4次和第5次训练间为7.7%.

2.4.4 连续两次逃避潜伏期低于70 s所占百分比

与第1次训练时的逃避潜伏期相比，2 次/d组和3 次/d组分别在第3次和第4次出现统计差异，并且两组的成绩提高率的最大差值分别在第3次和第4次，因此综合判定第3次和第4次分别为2 次/d组和3 次/d组的学习成绩拐点.此时两组的逃避潜伏期均在70 s左右，为避免偶然性，我们选择逃避潜伏期连续2次低于70 s作为小鼠记忆形成的标准.

如表2结果所示，第9次结束训练后，2 次/d组和3 次/d组连续2次逃避潜伏期低于70 s的小鼠占总数的80.25%和81.69%.在10～15次训练，两组余下20%的小鼠出现连续2次逃避潜伏期低于70 s所占百分比均在5%以下.

表1 两组小鼠不同训练次数下的学习成绩提高率(%)

表2 两组逃避潜伏期连续两次低于70 s所占百分比(%)

3 讨 论

在MWM实验中，小鼠可通过一定时程的多次训练而获得对空间的认知.但目前训练方式、总训练时程对训练有无影响以及选取哪种训练方式缺乏相应的实验依据.查阅文献发现有每天训练1次、5天共5次[10]，每天训练2次、4天共8次[11-12]，每天训练3次、5天共15次[13]，每天训练4次、4天共16次[14]，每天8次、2天共16次[15]等，其中应用较多的是每天训练2次或3次、总训练次数15次.因此本文选择每天训练2、3次、总训练次数15次进行定位航行实验，以游泳速度判断各组及各批次小鼠学习成绩的差异非体力及速度差异所致；以逃避潜伏期并辅以外环滞留时间百分比及目标象限滞留时间百分比进行学习成绩判定.结果显示连续15次训练完成后，同一训练次数下，2 次/d组和3 次/d组小鼠相比各指标均无统计学差异；每组不同批次小鼠间各指标均无统计学差异.说明两种训练方式小鼠学习成绩没有明显差别，且本实验选择的两种训练方式具有良好的重现性，因此建议根据实验具体情况选择每天训练2次或3次均可.

为探究小鼠学习记忆规律，本文对两组各3批小鼠的学习记忆成绩进行了动态分析.结果显示：与自身第1次相比，2 次/d组小鼠除游泳速度外的各项指标均在第3次开始出现统计学差异，并且2 次/d组学习成绩提高率的最大差值在第3次与第4次训练之间，即2 次/d组小鼠于第3次训练时学习成绩出现拐点.3 次/d组小鼠除游泳速度外的各项指标均在第3或4次训练时开始出现统计学差异，并且3 次/d组学习成绩提高率的最大差值在第4次与第5次之间，即3 次/d组小鼠于第4次训练时出现学习成绩拐点.

由于第3次和第4次分别为2 次/d组和3 次/d组的学习成绩拐点，并且与自身第1次学习成绩相比，2 次/d组和3 次/d组的各项指标均在第3或4次开始出现统计学差异，此时两组的逃避潜伏期均在70 s左右，因此我们认为当实验小鼠学习成绩出现拐点且具有统计学差异时的逃避潜伏期(本文为70 s)可以表示其开始对平台所在位置形成记忆.本实验在单次训练时间120 s情况下，以小鼠逃避潜伏期连续2次低于70 s(即出现学习成绩拐点且具有统计学差异时的逃避潜伏期)作为单只小鼠记住平台位置的标准，来讨论小鼠在何时对平台形成记忆.实验结果发现两组小鼠在第9次训练后，连续2次逃避潜伏期低于70 s的小鼠均占80%以上，且在第10～15次训练结束后余下20%的小鼠逃避潜伏期连续2次低于70 s所占百分比均在5%以下.表明小鼠经过一段时间的学习后，其学习成绩会稳定在某一水平，随训练时间延长成绩提高缓慢，过多的训练次数反而会加重实验负担.因此在进行定位航行时推荐总训练次数为9～10次.同时建议可将学习记忆成绩的变化轨迹作为观察指标用于动物模型或药物对学习记忆干预研究中.