铜陵地区脑卒中病人MTHFR C677T 基因多态性分布及同型半胱氨酸水平分析

朱娟娟，崇慧峰，胡志军，吴宝明，潘晓龙，李旭光，唐吉斌

脑血管病是我国成年人致死和致残的首位原因，《中国脑卒中防治报告2018》概要指出，由于社会老龄化及不健康生活方式的流行，我国脑卒中有爆发式增长的态势，并且呈现出性别和地域差异明显以及年轻化的趋势［1］。血液中同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平增高被认为是脑卒中发病的风险因素之一［2］，其水平的增高受非遗传因素和遗传因素的影响：叶酸缺乏及糖摄入增加是常见的导致Hcy水平增高的非遗传因素，而5，10-亚甲基四氢叶 酸 还 原 酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）活性下降是导致Hcy水平增高的主要遗传性因素之一［3］。

MTHFR是Hcy代谢与叶酸代谢中的关键酶，它可催化5，10-亚甲基四氢叶酸使血中Hcy 发生甲基化，维持其在血中的水平。MTHFR C677T基因多态性是由第677 位的点突变导致的，突变导致的酶活性下降可引起高Hcy血症［4］。

目前关于MTHFR C677T 基因多态性与脑卒中的关系越来越引起人们的重视，但由于其基因分布频率受地域和种族影响［5］，研究结果尚有争议，本研究以铜陵地区脑卒中人群作为研究对象，分析该人群MTHFR C677T基因多态性分布及Hcy水平，探讨脑卒中发生的风险因素并为其个体化防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月到2019年4月铜陵市人民医院住院的脑卒中病人234 例为研究对象，均为长期居住本地的汉族人。经头颅CT或MRI检查，符合中华医学会第四届全国脑血管病学术会议提出的各项脑血管病诊断标准，其中出血性脑卒中82 例，缺血性脑卒中152 例；男性140 例，女性94例；年龄范围为23～92岁，年龄69岁，234例病人均进行MTHFR C677T基因多态性检测，其中227例进行了Hcy检测。选取同时间段无冠心病、高血压、脑血管病于医院其他科室69例住院病人为对照组，其中男性35例，女性34例；年龄范围为22～88岁，年龄55 岁，69 例对照组均进行MTHFR C677T 基因多态性检测，其中67例进行了Hcy检测。记录研究对象身高、体质量、有无高血压史，并计算体质量指数（Body Mass Index，BMI）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。病人或近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 PyroMark Q24 焦磷酸测序仪（德国凯杰公司），高速低温离心机（德国赫担驰公司），基因扩增仪（北京东胜创新生物科技有限公司），全血基因组提取试剂盒及测序反应通用试剂盒（长沙三济公司），基因扩增试剂（日本Takara 公司），扩增引物（上海捷瑞生物工程有限公司），全自动生化分析仪（德国西门子公司），Hcy 检测试剂盒（安徽大千生物工程有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集 清晨采集受试者空腹静脉血标本，乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA dipotassium salt，EDTA-K2）抗凝血2 mL 用于基因测序，未抗凝血2 mL待充分凝固后离心留取血清用于Hcy检测。

1.3.2 全血基因组DNA 提取 采用柱式法从外周血细胞中将基因组DNA提取纯化，严格按照试剂盒说明书进行操作，提取后的DNA 可短期保存于2～8 ℃或长期冻存于-20 ℃和-80 ℃。

1.3.3 PCR 扩增 PCR 扩增反应体系含样本DNA 2 µL、Taq 酶0.5 µL、正向引物和反向引物各1 µL、缓冲液5µL、dNTP 3µL，最后用纯水补足总反应体系50µL。扩增条件为：94 ℃5 min，94℃25 s，56 ℃25 s，72 ℃25 s，共35 个循环，72 ℃5 min 后扩增产物可进行测序。

1.3.4 基因测序 通过PyroMark Q24MDx系统采用焦磷酸测序法测定MTHFR C677T位点，确定各样本基因型。

1.3.5 Hcy检测 酶循环法检测血清Hcy水平。

1.4 统计学方法 使用SPSS 22.0 进行统计分析，定性资料的描述使用百分比，统计推断使用χ2检验，定量资料不服从正态分布时，统计描述使用中位数和四分位数间距，三样本之间的比较使用Kruskal-Wallis H检验，P＜0.05表示差异有统计学意义，两样本之间的比较使用Mann-Whitney U 检验，组间两两比较时校正后的检验水准α＝0.05/3＝0.017，同时以Hcy 为因变量进行多元线性回归分析，评价基因型、性别、年龄、BMI等对Hcy水平的影响。

2 结果

2.1 MTHFR C677T 基因型检测结果分析 PCR产物经焦磷酸测序后，仪器测得峰高与检测位点结合模板的碱基数量成正比，经软件处理后自动转化为序列信息，确定该样本携带的基因型。见图1。

图1 MTHFR C677T基因测序结果分析图：A为野生纯合型（CC），B为杂合突变型（CT），C为纯合突变型（TT）

2.2 MTHFR C677T 基因型频率及等位基因频率 如表1所示，本研究中脑卒中组MTHFR C677T的野生纯合基因型（CC）、杂合突变型基因型（CT）和纯合突变型基因型（TT）的分布频率分别为31.2%、48.7%和20.1%，脑卒中组TT 基因型频率高于对照组TT基因型频率，差异有统计学意义（P＜0.05），而CC、CT 基因型频率在两组中分布差异无统计学意义（P＞0.05）；脑卒中组和对照组T等位基因分布频率分别为44.4%和33.3%，脑卒中组T等位基因分布频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。如表2 所示，在脑卒中组中，不同性别的病人MTHFR C677T基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 MTHFR C677T 基因型及等位基因的分布频率/例（%）

表2 MTHFR C677T 基因型在不同性别脑卒中病人中的分布频率/例（%）

2.3 MTHFR C677T 基因型与Hcy 水平的相关性 如表3 所示，在脑卒中组中，TT 基因型病人的Hcy 水平高于CC 基因型和CT 基因型，差异有统计学意义（P＜0.01），而对照组三种不同基因型之间Hcy 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。将脑卒中组和对照组同种基因型的Hcy 水平进行比较，可以看出脑卒中组Hcy 水平均增高，其中TT 基因型的Hcy水平在两组间有差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 MTHFR C677T 基因型与血清Hcy水平的关系/（µmol/L）

2.4 Hcy水平与其他变量的多元线性回归 以Hcy为因变量，MTHFR C677T 不同基因型、性别、年龄、有无高血压史和BMI 为自变量进行的多元逐步分析结果显示，仅基因型、性别、高血压史与Hcy 存在显著的线性关联，回归结果见表4，当基因型由野生型（CC）向杂合突变（CT）及纯合突变（TT）的转化时，Hcy水平也会随之增加，男性和有高血压的病人Hcy水平也会增加。

表4 影响同型半胱氨酸水平的多元线性回归分析

3 讨论

脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点［6］，可造成个人及国家的大量医疗支出，如能采取有效的措施早期干预其发病的危险因素，可显著降低致残率和致死率。

血液中高浓度的Hcy 会干扰血管内皮细胞功能，导致凝血和纤溶系统异常，使机体处于血栓前状态，也可作用于内皮细胞，使血管收缩，血压上升，促使动脉粥样硬化形成，增加脑血管病的发生风险［4］。有研究认为高Hcy血症是独立于高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟和年龄之外，引发心血管疾病的一个独立的危险因素［7］。但也有文献指出目前国外的许多心血管疾病指南均未把高Hcy血症作为心血管病的危险因素，并不赞同高Hcy血症是心脑血管疾病的独立危险因素的说法［8］。总体来说，国内的大多研究认为高Hcy血症是影响高血压病人心血管病预后的重要危险因素［9］。降低血中Hcy水平可有效减低脑卒中的发病风险且改善急性脑梗死病人预后［10-11］。

MTHFR 是影响血中Hcy 水平的主要遗传性因素之一，它是叶酸代谢过程中的关键酶［12］，MTHFR C677T是目前研究最多的基因多态位点，由于第677位的碱基胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置换导致，导致其编码产物由丙氨酸被缬氨酸替代，从而影响酶的活性。这种点突变可产生三种基因型，分别是野生纯合型CC，杂合突变型CT，纯合突变型TT，CT型的酶活性是CC 型的65%，TT 型的活性仅为CC 型的30%［13］。目前，MTHFR C677T基因多态性与脑卒中相关性的研究很多：Li 等［14］指出中国人群MTHFR C677T 基因多态性与缺血性脑卒中发病相关，可能是由于其影响血中Hcy 水平所致；Zhao 等［15］认为在中国高血压病人中，MTHFR C677T基因型和叶酸补充与Hcy 对第一次卒中的影响密切相关，而且叶酸干预能显著降低CC和CT基因型病人由高Hcy导致的卒中风险，提示可根据个体遗传背景和营养状况对脑卒中进行防治；张露等［16］却认为MTHFR C677T 基因突变可能与缺血性脑卒中无关；王超等［17］的研究也表明MTHFR C677T 基因在脑卒中组和健康人群组中的分布没有差异。造成研究结果差异的原因可能是由于研究样本量和分析方法不同导致，也有可能是研究人群具有不同遗传背景和营养状况导致，据报道中国人群具有较高的MTHFR C677T的突变频率［13］，且由于饮食烹饪习惯的原因导致大部分中国成年人（尤其在北方）叶酸摄入较低［1］，会导致较高的Hcy水平和脑卒中发病风险。

本研究中安徽铜陵地区脑卒中人群MTHFR C677T突变的T等位基因频率为45.1%，低于黑龙江地区［17］，高于广州地区［18］，说明该基因有一定的地域特点。脑卒中组MTHFR C677T 突变基因T 的频率高于对照组，提示在铜陵地区脑卒中可能与MTHFR C677T基因多态性相关。有报道指出MTHFR C677T 基因多态分布有性别差异［19］，但本研究中并未体现。在将脑卒中组和对照组进行同种基因型Hcy 水平的比较时发现，脑卒中组均具有较高的Hcy水平，尤其TT基因型Hcy水平增高差异有统计学意义，提示当TT基因型和高Hcy的同时存在时脑卒中有较高的发病风险。脑卒中组三种基因型中TT基因型的Hcy水平高于其他两种基因型，可能是由于纯合突变的基因导致酶活性明显下降所致。对影响Hcy水平的其他因素进行多元线性回归结果显示，除了MTHFR C677T 的基因型，性别及高血压史也会对Hcy 水平造成一定影响，这也就解释了对照组三种基因型之间Hcy 水平无明显差异的原因，除了MTHFR C677T基因多态性，Hcy水平还可能受性别和血压情况等多种因素的影响。由于本研究是回顾性研究，研究对象叶酸摄取情况无法获得，因此进一步扩大研究样本量并对病人叶酸摄取情况进行问卷调查是我们接下来要做的工作。

综上所述，本研究结果表明，铜陵地区脑卒中病人具有较高的MTHFR C677T基因的突变频率和Hcy水平，可能是脑卒中发病的风险因素。进行MTHFR C677T基因多态性和Hcy水平的检测有助于筛选脑卒中高危人群，并有望根据基因型及Hcy水平进行不同剂量的叶酸补充，即个体化地指导脑卒中的一级预防和药物治疗，可极大地减轻病人和社会的负担。