HPLC-ELSD法测定玉液消渴颗粒中黄芪甲苷的含量

赵俊苹，秦 颖，郝美玲

(1.呼和浩特市食品药品检验所，内蒙古 呼和浩特 010020；2.巴彦淖尔市食品药品检验所，内蒙古 巴彦淖尔 015100；3.内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010020)

玉液消渴颗粒收载于部颁标准成方制剂[1]，处方由黄芪、葛根、山药、知母、天花粉、鸡内金、五味子、太子参八味药组成，具有益气滋阴的功效，用于糖尿病消渴乏力，口渴多饮，多尿症。部颁标准中只收载了性状和检查项，无含量测定项，标准简单，无法有效控制产品质量，文献报道[2-3]，黄芪具有补气、利水、固表止汗、生津养血、形滞通庳、托毒排脓等作用，是补气的良药，在玉液消渴颗粒中属君药，处方用量较大，所以首先考虑以黄芪的主要成分黄芪甲苷作为定量质控指标进行研究，目前收集到两个厂家共六批次样品，其中一个厂家采用部颁标准检验，另一个厂家注册时增订了黄芪甲苷的含量测定，采用双波长薄层扫描法测定[4]，此法费时，操作繁琐，方法检测灵敏度低，测定的数据误差较大，质量可控性差，参照《中国药典》2015年版一部玉屏风颗粒含量测定项下方法[5]，采用HPLC-ELSD法对玉液消渴颗粒中的黄芪甲苷含量进行实验摸索，经方法学考察验证后，阴性对照没有干扰，方法准确，可靠，用于有效控制玉液消渴颗粒的质量是可行的。

1 材料

1.1 仪器

岛津20A液相色谱仪(检测器:Alltech-ELSD6000);KQ-500DE数控超声波清洗器；Sartorius电子天平。

1.2 药品与试剂

黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110781-201515，供含量测定用，纯度以93.0%计);玉液消渴颗粒(陕西君碧莎制药有限公司，批号20160401、20160802、20201202、20201203)，沈阳飞龙药业有限公司，批号：20151204、20151205)；甲醇、正丁醇、氨水为分析纯，水为超纯水，乙腈为色谱纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)，柱温：30℃，流动相：乙腈∶水(32∶68)，流速：1.0mL/min，检测器漂移管温度：108℃，载气流量2.8L/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

取装量差异项下的本品，研细，取约15g，精密称定，置索氏提取器中，加入甲醇冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流至提取液无色(约6小时)，提取液回收溶剂至干，残渣加水20mL微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，合并氨试液并用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20mL，弃去氨试液，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备

取本药处方中除黄芪外的其他药材，按玉液消渴颗粒的制备工艺制成颗粒，再按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系考察

取黄芪甲苷对照品2.732mg(纯度93.0%)，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀(含黄芪甲苷0.2540mg/mL)，精密吸取5μL、10μL、15μL、20μL、30μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定,以对照品溶液浓度的自然对数(X)对峰面积的自然对数(Y)进行回归分析，回归方程为： Y=1.626X+12.597 r = 0.9992，结果表明，黄芪甲苷在1.270μg～7.622μg范围内线性关系良好。

2.3.2专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，阴性对照溶液无干扰，黄芪甲苷峰和相邻杂峰良好分离，理论板数按黄芪甲苷峰计算大于10000。色谱图见图1、图2、图3。

2.3.3精密度试验

精密吸取2.2.1中对照品溶液20μL，重复进样5次，测得黄芪甲苷峰面积RSD为1.1%。表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性实验

精密吸取供试品溶液，分别于0h、2h、4h、7h、9h、11h、14h进样20μL，测定黄芪甲苷峰面积，结果黄芪甲苷峰面积积分值RSD为1.6%，表明供试品溶液在14小时内稳定。

2.3.5重复性试验

精密称取同一批供试品(批号：20160401)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定黄芪甲苷的含量，结果黄芪甲苷的平均含量为0.096mg/g，RSD为1.1%，表明本方法重复性好。

2.3.6加样回收试验

取已知含量的同一供试品(批号20160401，含黄芪甲苷0.096mg/g)9份，各约7.5g，精密称定，置索氏提取器中，按低、中、高浓度黄芪甲苷对照品加入量与所取供试品中黄芪甲苷量之比约0.5∶1、1∶1、1.5∶1，分为3组，分别加入黄芪甲苷对照品溶液(黄芪甲苷对照品溶液浓度0.3925mg/mL,纯度93.0%)1.0mL、2.0mL、3.0mL，加甲醇浸泡过夜，再加甲醇适量，加热回流至提取液无色(约6小时)，提取液回收溶剂至干，残渣加水20mL微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次……以下提取方法同“2.2.2供试品溶液制备法”……取续滤液，按“2.1”项下色谱条件测定，进样20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果平均回收率为93.5%，RSD为2.2%。

2.3.7样品含量测定

取四批样品按“2.2.2”项下方法制备，并按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，每批样品取两份样，计算含量，取其含量平均值，结果见表1：

表1 样品中黄芪甲苷含量测定结果(n=2)

2.3.8耐用性试验

取同一供试品溶液(“2.3.5”项下的1号和2号样液)按“2.1”项下色谱条件，对Agileng C18(250×4.6mm,5μm)柱和PhenomenexC18(250×4.6mm,5μm)柱进行比较，结果，如表2：

表2 不同色谱柱的耐用性试验

3 讨论

3.1 提取方法和时间的考察

在供试品提取方法中，用甲醇超声处理和加热回流提取样品，结果超声处理后的供试品溶液在放置过程中有絮状沉淀，无法测定，故采用回流提取方法处理样品。

供试品在加热回流提取时，采用直接加热回流2小时、3小时、4小时以及索氏回流提取(约6小时)进行考察，索氏提取测得含量略偏高，又考虑到索氏提取效率更高，故选择索氏回流提取。

参照中国药典一部[5]一些成方制剂，黄芪甲苷的提取方法都比较繁琐，为了能简化提取方法，在实验摸索的过程中，参照中国药典2020年版一部[6]黄芪药材黄芪甲苷测定项下，供试品溶液的制备采用含4%浓氨试液的80%甲醇溶液进行加热回流提取，结果供试品溶液粘稠，影响测定，考虑到玉液消渴颗粒为复方制剂，药味多，制作时有大量辅料添加，故此法不宜。

查阅相关文献资料[7]，黄芪甲苷属于三萜皂苷，极性较大，难溶于丙酮、乙醚，在含水正丁醇中有较大的溶解性，针对黄芪甲苷的含量测定已有一些研究[8-9]，所以经过试验，用水饱和的正丁醇进一步提取黄芪甲苷是较好的选择。

3.2 漂移管温度和载气流速的考察

基于蒸发光散射检测器的特点，漂移管的温度和载气流速对基线的稳定和峰面积影响较大，通过对漂移管分别为101.6℃、103℃、105℃、108℃四个温度时，载气流速分别为2.7L/min和2.8L/min之间进行试验考察，发现漂移管温度为108℃，载气流速为2.8L/min时，峰面积值稳定，基线平稳，所以最终确定漂移管温度为108℃，载气流速为2.8L/min。