无形体分泌蛋白Ats-1与宿主细胞互作蛋白筛选及其生物信息分析

王勇，郑炜，马忠臣，唐燕，张辉，张丽娟，陈创夫*

(1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003;2 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 102206)

嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum，APH)感染引起人粒细胞无形体病(HGA)，一种蜱传人兽共患病。嗜吞噬细胞无形体已进化出适应宿主细胞环境的机制，在白细胞(如粒细胞、单核细胞)中形成包涵体而存在[1-2]。嗜吞噬细胞无形体感染常导致宿主细胞多种生物过程发生改变如细胞分化与增殖、免疫应答、溶酶体融合、凋亡、信号转导等[3-4]，然而，嗜吞噬细胞无形体侵染宿主细胞的致病机制仍待深入研究。研究报道，嗜吞噬细胞无形体Ats-1蛋白作为病原毒力因子，在调控病原入侵、胞内生存繁殖以及宿主细胞生物过程等方面起重要作用[5]。Ats-1蛋白是嗜吞噬细胞无形体四型分泌系统的效应蛋白，可定位到受感染细胞线粒体基质中，部分导致抗凋亡效应。大部分Ats-1蛋白位于宿主细胞质中，可能参与调控宿主细胞内生物学过程，其详细的信号机制及通路有待进一步深入研究[5-6]。

为了解中国人源嗜吞噬细胞无形体分离株分子致病机理，本研究利用酵母双杂交技术筛选出与Ats-1蛋白互作的宿主细胞靶蛋白，并分析了宿主细胞靶蛋白在病原感染过程中可能发挥的调控作用，为深入了解嗜吞噬细胞无形体分子致病机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞与质粒

2009—2010年间于中国山东莱州湾地区无形体病人分离到的2株人源致病菌(LZ-HGA-agent-3和LZ-HGA-agent-4)，以及从长角血蜱(H.longicornis)分离到的1株蜱源无形体分离株(LZ-HGA-agent-T1)，3株中国无形体分离株通过HL60细胞培养并由本室保藏[7-8]。大肠杆菌DH5α由本室保存，大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞和克隆载体pEASY-T1购自北京全式金生物技术有限公司，酿酒酵母菌株Y2HGold和Y187、质粒pGBKT7 DNA-BD、pGADT7-Rec、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-T均购自Clontech公司，人单核细胞白血病细胞(THP-1)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 主要试剂

DNeasy©Blood & Tissue kit、RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司，YeastmakerTMYeast Transformation System 2、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System，营养缺陷培养基SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal(QDO/X)均购自Clontech公司，X-α-Gal购自生工生物工程(上海)股份有限公司，NdeⅠ/BamHⅠ购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物设计

根据GenBank公布的A.phagocytophilumHZ株ats-1基因(FJ210653) 序列，利用软件Primer Premier 5.0设计PCR扩增ats-1基因引物，并在上、下游引物上分别加上NdeⅠ、BamHⅠ酶切位点，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.2.2ats-1序列PCR扩增、测序及分析

将测序并人工校对过的ats-1基因序列输入到http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/中的nucleotide blast 程序中进行序列比对分析。DNASTAR Lasergene v7.1.0程序包中的EditSeq程序对ats-1基因序列及其氨基酸序列进行编辑修饰、MegAlign程序对ats-1基因序列及氨基酸序列序列与国际参考株相应序列进行比对分析。由于ats-1基因核酸水平及其所编码氨基酸水平与嗜吞噬细胞无形体HZ株ats-1差异不明显，故仅分析其蛋白三级结构信息。用Galaxy TBM(http://galaxy.seoklab.org/)分析Ats-1蛋白的三级结构。利用String(https://string-db.org/) 在线程序分析Ats-1蛋白细菌内互作网络图(confidence设为0.7，其它参数设为默认)。

1.2.3 诱饵载体构建及其自激活、毒性检测

空载体pGBKT7 DNA-BD、重组质粒pEASY-ats-1经过NdeⅠ/BamHⅠ双酶切后，回收的pGBKT7大片段、ats-1进行连接并转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，最后涂布LB/Kan+平板，37 ℃倒置过夜培养。经PCR、酶切及测序分析鉴定阳性重组质粒pGBKT7-ats-1转化酵母菌Y2HGold感受态细胞，步骤参考YeastmakerTMYeast Transformation System 2说明书。酵母转化子涂布于SD/-Trp/Kan+平板培养后经PCR及测序方鉴定阳性重组质粒。酿酒酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)涂布SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板30 ℃培养4～5 d，观察菌落生长及颜色等判断是否有自激活作用；从SD/-Trp平板上挑选最大菌落接种SD/-Trp/Kan+液体培养基30 ℃，250 r/min振荡过夜培养(16～24 h)，测培养物的OD600值，判断是否有毒性。以Y2HGold(pGBKT7 DNA-BD)为试验对照。

1.2.4 人单核细胞白血病细胞(THP-1)cDNA文库的构建及分析

用RNeasy Mini Kit抽提THP-1细胞总RNA，测定总RNA纯度及浓度。利用Clontech公司Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System进行cDNA合成及纯化。根据YeastmakerTMYeast Transformation System 2说明书进行pGADT7-Rec和cDNA共转化酵母菌株Y187，酵母转化液涂布SD/-Leu平板；同时转化pGADT7-Rec、pGADT7-Rec+SV40 large T至Y187做为阴、阳性对照，对照转化酵母菌涂布SD/-Leu平板；所有转化酵母菌于30 ℃培养3～5 d。收集SD/-Leu平板上Y187酵母转化子，-70 ℃冻存cDNA文库。取适量Y187(pGADT7-cDNA)冻存液涂布SD/-Leu平板培养并观察是否有杂菌生长。Y187(pGADT7-cDNA)冻存液按10-2，10-3，10-4比例稀释后分别涂布于SD/-Leu平板培养并计算SD/-Leu板上菌落数及库容量。提取Y187(pGADT7-cDNA)冻存液酵母质粒pGADT7-cDNA并转化Trans1 T1感受态细胞，并进行菌液PCR扩增、电泳分析，评估cDNA文库插入片段长度。

1.2.5 Ats-1蛋白与THP-1细胞互作靶蛋白筛选及生物信息分析

构建的Y2HGold(pGBKT7-ats-1)与Y187(pGADT7-cDNA)进行酵母双杂交，同时做阳性对照(Y2HGold [pGBKT7-53]×Y187 [pGADT7-T])、阴性对照(Y2HGold [pGBKT7-Lam]×Y187 [pGADT7-T])，操作按MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System说明书进行。酵母菌液分别涂布于DDO、QDO、QDO/X培养基平板筛选阳性克隆子，通过PCR扩增、测序确定捕获靶蛋白基因，通过在线程序https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi、http://www.ebi.ac.uk/对捕获靶蛋白进行GO生物信息分析。利用String(https://string-db.org/) 在线程序分析捕获蛋白宿主胞内互作网络图(confidence设为0.9，其它参数设为默认)。

2 结果与分析

2.1 ats-1 PCR扩增及序列生物信息分析结果

A.phagocytophilumLZ-HGA-Agentats-1基因经PCR扩增、测序分析获得885 bp预期长度片断(图1)。ats-1序列与国际参考株A.phagocytophilumHZ株ats-1同源性为99%，仅一个核酸差异；所编码氨基酸序列同源性100%。A.phagocytophilumLZ-HGA-Agent Ats-1蛋白三级结构(图2)。Ats-1蛋白嗜吞噬无形体内互作网络图(图3)。Ats-1可能与VirD4、AnkA、AmpA、APH_0032和 APH_0860互作。

1-4—目的基因ats-1; 5—阳性对照; 6—阴性对照; M—DNA Marker 2 000图1 目的基因ats-1的PCR扩增

图2 Ats-1蛋白质三级结构预测

图3 Ats-1蛋白质无形体内互作网络图

2.2 酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)自激活、毒性检测

涂布Y2HGold(pGBKT7-ats-1)的SD/-Trp平板、SD/-Trp/X-α-Gal平板上均有菌落长出且直径大于2 mm，而SD/-Trp/X-α-Gal平板上菌落不变蓝。证明酿酒酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)无自激活作用。

震荡培养24 h后的酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)菌液的OD600值均大于1.0(>0.8即判定为无毒性)，而且与Y2HGold(pGBKT7 DNA-BD)菌液相比，生长情况基本一致。证明酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-ats-1)无毒性。

2.3 THP-1 cDNA文库评价

2.3.1 Y187(pGADT7-cDNA)文库克隆数、转化效率及污染检测

150 μL 10-2稀释菌液涂布SD/-Leu平板，平均每个平板克隆数为400，则15 mL重悬液克隆数(库容量)=(400÷0.15)×100×15=4×106个克隆。转化效率=(400×15)÷(0.15×3.94)×100=1.02×106cfu/μg。涂布Y187(pGADT7-cDNA)冻存液的SD/-Leu平板上没有出现污染物。

2.3.2 cDNA文库插入片段评价

共挑取51个单菌落进行PCR扩增，其中49个菌落扩增到条带，2个菌落未扩增到条带，部分菌落PCR结果见图2；PCR分析证实cDNA文库插入片段在100～3 000 bp之间，片段主要集中于500～2 000 bp间(图4)。由菌落PCR推算得知重组率为(51-2)/51=96.1%。

注：M为DNA Marker 5 000; 1-45为cDNA 插入片段; 46为阴性对照图4 PCR鉴定cDNA文库插入片段大小

2.4 酵母双杂交实验及分析

酿酒酵母菌株Y2HGold(pGBKT7-ats-1)与Y187(pGADT7-cDNA)经杂交后，在QDO平板上长出单菌落。再将这些菌落转接到QDO/X平板上，部分菌落变蓝(图5)。

图5 Y2HGold(pGBKT7-ats-1)与Y187(pGADT7-cDNA)杂交结果

2.5 Ats-1蛋白与THP-1细胞互作潜蛋白鉴定与分析

与Ats-1蛋白互作的捕获蛋白基因PCR产物测序、Blastn及http://www.ebi.ac.uk/等分析，7个阳性捕获靶蛋白生物信息分析结果见表1，由此可知，捕获的宿主靶蛋白主要参与细胞分化增殖、细胞凋亡、自噬、炎症等生物学过程。捕获蛋白宿主胞内互作网络图(图6)，由此可知，ZFP36L2可能与ZDHHC9-GOLGA7复合物互作；LGALS1主要与凝血因子F5、纤维蛋白原FGG和FGA、IL-6、TIMP1、载脂蛋白APOA1、GTPase HRAS等互作；TIMP1主要与基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14)、白介素IL-6和IL-10、血小板反应蛋白THBS1以及转生长因子TGFB1等互作；EEF1A1主要与真核细胞核糖体蛋白、翻译延伸因子1复合体互作;PTMA与副甲状腺素PTMS互作;ATRN与E3泛素化蛋白连接酶MGRN1互作。

表1 THP-1细胞捕获靶蛋白及其生物信息分析

注：A、B、C、D、E、F分别代表捕获蛋白ZFP36L2、LGALS1、TIMP1、EEF1A1、PTMA、ATRN在宿主胞内互作网络图图6 捕获蛋白宿主胞内互作网络图

3 讨论

人粒细胞无形体病(HGA)症状主要是发热、肌痛、头痛、血小板减少、白细胞减少、贫血，以及轻、中度肝损伤导致血清中天冬氨酸、丙氨酸氨基转移酶活性升高，病症严重度从无症状到死亡不等[4]；同时伴随有严重并发症包括脓毒性休克样综合征(SSLS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和机会感染。HGA病例中，36%需住院治疗，7%需重症监护(ICU)，0.6%死亡。因此，探究该病的发病机理，特别是分子致病机理，对防控和治疗该病至关重要[9]。

本研究为了探讨嗜吞噬细胞无形体(APH)致病机理，从三个水平—细菌水平、宿主细胞水平以及细菌-宿主互作水平—开展实验及生物信息学研究。

在细菌水平上，我们利用生物信息学方法分析了嗜吞噬细胞无形体分泌蛋白Ats-1在细菌胞内可能的互作网络图(见图3)。已有文献通过细菌双杂交系统(利用APH的VirD4为诱饵与APH基因组为prey文库进行杂交)筛选到一个假定蛋白(命名无形体易位底物1，Ats-1)[5]，因此可知分泌蛋白Ats-1是四型分泌系统(T4SS)的一个底物，可以与T4SS的组分VirD4相互作用，本研究中生物信息学分析结果与上述实验结果相一致。串联重复序列的酸性蛋白，APH_0032，分泌后定位在囊泡内的APH表面及包涵体膜的基质侧膜上[10],该蛋白膜定位作用表明：它在包涵体膜生物发生过程中起作用，这一生物发生过程还需要进一步实验确定。分泌的效应蛋白AmpA 可以劫持宿主细胞泛素化作用，调节病原菌胞内感染，有利于病原菌胞内生存[11]。

嗜吞噬细胞无形体(APH)扰乱破坏机体防御细胞(如人粒细胞和单核细胞)可能导致人类疾病发生[1]。尽管宿主免疫细胞可通过多种机制如活性氧产生、抗菌肽和酶的分泌等机制作用并清除病原菌[9]，但APH依然能在这些细胞中生存繁殖，其分子致病机理仍待深入研究。因此，细菌-宿主互作水平上，本研究选用中国人源APH分离株LZ-HGA-Agent Ats-1蛋白和人单核细胞THP-1为研究重点，通过酵母双杂交筛选到与Ats-1蛋白互作的THP-1细胞靶蛋白7个，生物信息分析显示，这些靶蛋白主要与宿主细胞的增殖分化、细胞凋亡、自噬、炎性反应、氧化应激应答、转录翻译调控等若干生物学过程有关(表1)。

在宿主细胞水平上，我们利用生物信息学方法分析了部分宿主细胞捕获蛋白在胞内的生物学过程(表1)以及可能的互作网络图(图3)。

HGA病人感染后出现贫血、白细胞减少、血小板减少等症状，但其发生原因不清楚[4]。Zhang[12]研究证实，经刺激物刺激可促使红细胞锌指蛋白36,C3H样2(ZFP36L2)转录因子表达增加，ZFP36L2转录因子结合到早期红系祖细胞的mRNA上,促使早期红系祖细胞更多地进行细胞分裂，最终形成更多的晚期红系祖细胞，进而能增加红细胞数量。从胞内互作网络图3 A，可知ZFP36L2可能与ZDHHC9-GOLGA7复合物互作。ZDHHC9-GOLGA7复合物是一个棕榈酰转移酶，主要跟 HRAS和NRAS运输有关，HRAS和NRAS蛋白是RAS/MAPK信号通路的组分，可以将胞外信号传递到胞核，指导细胞增殖、成熟和分化，如果该通路受影响可能导致细胞数量减少。本研究分析推测，中国APH分离株蛋白Ats-1可能与宿主细胞蛋白ZFP36L2、EEF1A1发生作用，引起HGA病人出现贫血症、白血球减少症。

半乳糖凝集素1(LGALS1)通过与多种细胞分子互作，可调节细胞-细胞、细胞-基质互作，参与多种细胞生理、病理过程如黏附、增殖、凋亡和炎症反应等[13](图3B)。在免疫反应中，LGALS1调节中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞的功能，还可诱导T淋巴细胞凋亡并具有抗炎功能，可抑制病原感染[13]。Belyi[14]研究发现EEF1A的GTPase结构域Ser53糖基化，可抑制真核宿主细胞蛋白合成以及细胞死亡。另外，EEF1A1还可以与真核细胞核糖体蛋白、翻译延伸因子1复合体互作，影响蛋白质翻译(图3D)。Jiang[15]研究发现PTMA通过抑制凋亡小体形成进而负调控线粒体介导的caspase-9活性。PTMS还可以抑制PTMA的免疫调节作用，进而可以抵抗细菌感染(图3E)。据此分析，中国APH分离株蛋白Ats-1与LGALS1、EEF1A、PTMA发生作用，可能影响了宿主细胞的黏附、增殖、凋亡、炎症反应等过程，从而导致病原逃逸宿主细胞的杀伤作用。

由图3C可知，人金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1)主要与基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14)、白介素IL-6和IL-10、血小板反应蛋白THBS1以及转生长因子TGFB1等互作。TIMP1属于TIMP家族，该家族所编码蛋白是基质金属蛋白酶(MMPs胞外基质降解相关的一组肽酶)的天然抑制剂，有促细胞生长、抗细胞凋亡功能。TIMP1可以激活酪氨酸/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而调控细胞生长与分化、炎症与细胞凋亡等[16]。由此推测中国APH分离株蛋白Ats-1与TIMP1作用，可能阻碍TIMP1功能发挥，从而使宿主细胞生长受抑，导致细胞数量减少。另外TIMP1可影响缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路，继而影响氧环境稳定性[17-18]。本研究分析：中国APH分离株侵袭机体后，造成机体病灶区氧含量低于正常值，由于病原Ats-1与HIF-1互作，影响了HIF-1蛋白功能的正常发挥，导致机体病灶区氧含量无法恢复正常值，有氧杀伤系统效能降低，从而有利于病原菌胞内生存。

总之，APH分子致病机制已成为研究热点，病原分子致病机理的详细研究有利于从分子水平上解释HGA病因。本研究从分子水平分析了蛋白-蛋白互作对病原菌分子致病机理、疾病病因的发生以及临床表现的可能影响。鉴于酵母双杂交技术的局限性，目前本研究小组正在进一步验证Ats-1与靶蛋白互作，研究蛋白-蛋白互作对信号通路的影响，进而为揭示HGA发病机理/病原分子致病机理提供科学数据。