重金属铜耐受突变株的高效构建方法

傅科鹤，范莉莉，李园园，熊国勇

(南昌师范学院生物系，330032，南昌)

0 引言

近几十年来，随着工业废水排放及农药的大量使用，导致土壤中铜的污染日趋严重，治理土壤铜污染成为普遍关注的一个问题[1-2]。传统的治理方法如沉淀法、离子交换法、电化学法、膜分离技术等方法成本高、选择性低、周期长，并可能产生二次污染。生物吸附能够很好地克服上述难题而受到广泛关注[3]。微生物由于分布广、生长迅速、抗逆性强等优点，在修复土壤重金属方面具有明显优势[4]。木霉菌是一种传统的生防菌，具有促进植物生长、抑制土壤病原菌、分布广泛，抗性强等特点，在生物修复方面被广泛使用[5]。

为获得高效修复土壤重金属污染的木霉菌，首先要筛选高耐受菌株。只有高耐受菌株才能够在污染土壤中繁殖，从而达到修复土壤污染的目的[6]。相比传统方法，ATMT技术能够更高效获得高耐受突变株，所获突变株不仅能够直接应用于土壤铜污染的修复，同时还能为挖掘木霉菌吸附和代谢铜相关基因资源，揭示木霉菌-铜互作分子机理提供重要工具。农杆菌介导的转化技术(ATMT)由于操作简便、外源DNA结构完整、转化机理清楚、整合位点稳定、拷贝数低及对目标基因组影响小等优点，已成为一种广泛应用的基因转化方法。自从1998年de Groot首次将其应用于丝状真菌的研究后[7]，已经有50多种丝状真菌成功通过ATMT转化。常规ATMT转化过程主要包括含目标质粒的农杆菌培养，与目标菌孢子共培养及抗性平板筛选。整个过程周期长，成本高(筛选过程用到的抗生素)。因此本研究通过改进转化过程中的抗性平板筛选步骤，使转化及筛选效率得到明显提高。建立一种高效突变株构建方法，能有效提高土壤重金属修复过程中菌株获得效率；同时，该方法有利于功能基因的克隆及分析，为构建高吸附铜工程菌株提供关键技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 农杆菌AGL1及质粒PC1300th由本实验改造并保存，里氏木霉菌株QM9414由浙江大学农学院章初龙副教授馈赠。

1.1.2 试剂 氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素、头孢霉素购自Amresco公司，分别配成100 mg/mL，0.45 μm滤膜无菌过滤，分装成小管，-20℃冻存备用；利福平用DMSO溶解后，配制成100 mg/mL，分装成小管，-20℃冻存备用；Cu2+由CuSO4溶解于蒸馏水中，配成10 mM母液，过滤除菌备用。

1.1.3 培养基 PDA培养基：马铃薯去皮200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1 000 mL；查氏培养基：NaNO33.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g， FeSO40.01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ATMT突变株构建载体改造 以pCAMBIA1300质粒为骨架，将其中的35S启动子换成适于真菌表达的Trpc启动子。pCAMBIA1300质粒用Xhol/EcoR1双酶切后，胶回收后得到切除了35S启动子及hph ORF的质粒pC1300-h。然后，以1003质粒为模板，TrphU/TrphL引物扩增含有Trpc启动子及hph ORF的1345 bp片段，片段两端加上Xhol/EcoR1酶切位点，胶回收片段后双酶切，与pC1300-h连接得到ATMT突变株构建载体pC1300th(图1)。具体构建方法参见Fu et al (2010)[8]。

(a)原始质粒；(b)改造后的质粒

1.2.2 ATMT转化方法改进 将含有质粒pC1300th的农杆菌菌株AGL1在LB平板上(含50 μg/mL的利福平与卡那霉素)划线活化48 h，然后挑单菌落转到20 mL LB液体培养基(含50 μg/mL利福平和链霉素)28℃、220 rpm振荡培养30 h；用5 mL IM培养基将生长4 d的木霉孢子冲洗后3层擦镜纸过滤，显微镜计数，用40 mL IM培养基稀释到终浓度1×106cfu/mL，28℃萌发6 h；测定农杆菌OD600，确定浓度；然后按量加入到100 mL IM培养基，终浓度达到OD600=0.3；28℃、240 rpm振荡培养6 h，测定OD，达到0.6即可；将农杆菌与木霉孢子液等量混匀后，按每平皿200 μL涂IM平板，静置30 min待水分吸干后，22℃共培养48 h；将玻璃纸转移到含高浓度铜筛选培养基(对野生菌株致死)筛选。培养时间不超过5 d。挑选疑似的转化子到CY培养基(含250 μg/mL特美汀及200 μg/mL潮霉素)，然后再用CY培养基(含250 μg/mL特美汀)传5代后，单孢分离后转接到含潮霉素的平板验证；提取突变子的基因组DNA，PCR验证。与传统的方法相比，改进方法主要是在最后一步转膜过程中，将共培养后的菌连同膜一起转移到含有高于野生株致死浓度的铜培养基上，将未转化的野生株及转化后但铜耐受性未提高的转化子全部杀死，最后能够生长的即为耐铜的转化子，原理见图2。

图2 ATMT方法改进示意图

1.2.3 DNA提取及PCR验证 DNA提取按照常规的CTAB法提取，-20℃冻存备用。通过PCR验证目标菌株中是否含有T-DNA序列，引物序列为：

fhphU:TGTCCTGCGGGTAAATAGC

fhphL:TTGTTGGAGCCGAAATCC

用于扩增载体中的选择标记基因潮霉素，产物为468 bp。

1.2.4 Southern blot 通过Southern blot验证T-DNA插入拷贝数。样品基因组DNA分别用限制性内切酶酶切后经1.0%琼脂糖凝胶电泳，80 V电泳2.5 h。将泡好的胶放入托盘，先把Marker所在的泳道切下，放入EB染液中染色；同时，将样品胶放入到足量的脱嘌呤液，缓慢振荡15 min，观察胶上的溴酚蓝变成黄色后，倒掉脱嘌呤液，无菌水清洗；加入足量的变性液，缓慢振荡30 min，弃溶液，无菌水清洗3遍，再加入变性液重复处理1次；加入足量中和液缓按上述方法进行中和。同时，切和凝胶同样长宽的尼龙膜和3张3 M滤纸，放入10×SSC溶液中润湿。将2张17 cm的大滤纸交叉叠放在搭建的转膜玻璃板上，将处理好的胶倒置放在上面，将润湿的3层滤纸紧贴胶面上，转膜24 h。转膜结束后，取下吸水纸和滤纸，将凝胶和尼龙膜一起翻转。将膜从胶上剥离，放入2×SSC溶液中漂洗5 min，取出平放在滤纸上，室温晾30 min。将晾干的膜放在2张滤纸间，在烘箱80℃烘烤2 h后，锡纸包裹好保存备用。探针标记和杂交采用Gene Images Alkphos Direct Labeling and Detection System Kit (Amersham)，操作根据说明书进行。预杂交至少1 h，加探针杂交16 h，洗膜、封膜后，进行X光拍照。

2 结果与分析

2.1 铜对野生株致死浓度测定

野生株活化后，打孔器取菌饼(0.5 mm直径)转接到含不同浓度Cu2+的PDA、YPDA及CYA培养基平板上，每12 h测量一次菌落直径，计算铜对里氏木霉的致死浓度。结果表明(图3)，当铜离子浓度达到2.0 mM时，里氏木霉不能在CYA培养基上生长，而在PDA及YPDA培养基上仍能生长；当铜离子浓度达到2.4 mM时，在PDA培养基上不能生长。而在YPDA培养基上，铜离子浓度达到3.6 mM时，才能完全抑制菌体生长。

(a)PDA培养基

(b)YPDA培养基

(c)CYA培养基

2.2 耐铜突变株构建

2.2.1 最佳铜离子浓度的确定 由于CYA培养基主要成份是无机盐，成分明确，实验重复性好，所以选用该培养基。为确定最佳的铜离子浓度(过高无法获得突变株，过低假阳性多)，设置5个浓度：2.2 mM、2.5 mM、2.8 mM、3.1 mM、3.3 mM。以常规潮霉素平板筛选为对照，每个处理转化20个平板(直径9 cm)，实验结果如表1。最佳的铜离子浓度为2.5 mM，此时，阳性率接近50%，而且获得的总假定突变株也比较合适，平均0.45个/平板。因此，选择该浓度为最佳铜离子浓度，用于大量构建并筛选高耐受铜的随机突变株。

表1 改进的ATMT方法与常规方法比较

2.2.2 耐受铜突变株的构建筛选 使用上述条件共转化320个平板，通过5代继代培养及单孢分离，获得纯化的突变株。以潮霉素为引物通过PCR扩增表明，14个突变株具有468 bp的阳性条，说明初步筛选获得了14个可能的突变株(图4(a))。为了进一步验证突变株，通过Southern blot对5个耐受性最强的突变株T-DNA拷贝数进一步验证。结果表明，5个突变株中有3个突变株含有2个，拷贝数，2个突变株为单拷贝(图4(b))。

(a)PCR验证；(b)5个突变株用HindIII酶切后Southern blot验证

图4 突变株的验证

3 结论与讨论

3.1 改进前后方法比较

常规的农杆菌介导转化(ATMT)突变株构建方法主要包含两部分：共培养与筛选。按照常规的方法，大量筛选突变株将是一个费时费力的工作，如突变株的继代培养，单孢分离，然后再测定铜的吸附能力等。而通过改进的方法后，获得的突变株数量大大减少，而且得到的突变株全部是高耐受突变株，从中筛选高吸附突变株概率明显增大。

与传统方法相比，改进的ATMT方法有两大优势。

3.1.1 减少了筛选的工作量 从表2可知，按照常规方法，20个平板共获得171可能的突变株；而改进后，仅获得11个可能的突变株，仅相当于前者的6.4%，所以大大节省了后续的筛选工作。当大量构建突变株时(突变株达到上万时)，这种优势更明显。另外，改进的方法获得直接用高浓度铜来筛选，因此，获得高耐受铜的突变株概率要比常规方法高。

3.1.2 减少材料损耗 共培养后，常规的方法通过使用抗生素(潮霉素与头孢霉素)来筛选突变株，而改进的方法只用含铜的培养基筛选，大大节省了抗生素的使用，减少了费用及抗生素对环境造成的污染。以构建1万株突变株(里氏木霉有9 000左右的蛋白，按1倍覆盖量计算)为例，常规方法平均每皿(直径9 cm)获得5.2个真正的突变株(按表2 CK数据计算)，1万突变株需要筛选1923皿，使用潮霉素与头孢分别为30 g与60 g，而且传代过程需要使用大量的培养基；而用改进的方法，在初筛选过程无需使用抗生素。

表2 ATMT方法优化前后的比较

注：潮霉素用量：0.2 g/L；头孢霉素用量：0.25 g/L；每L培养基倒60个平板(直径9 cm)。

3.2 改进方法使用过程注意事项

对突变株构建过程中的筛选步骤进行改进，用含高浓度铜的培养基直接筛选可能的转化子，通过一系列实验后优化出一种快速构建高耐受铜突变株方法。应用过程中需注意以下几个方面。

1)木霉分生孢子生长。28℃倒置培养4 d，培养皿不能用palm膜封口，以免影响通气而影响孢子质量。

2)农杆菌生长。农杆菌用IM培养基诱导培养时，起始OD值0.3左右，培养5 h后，测定OD值，如果OD值未达到0.6，可以离心浓缩。

3)共培养。共培养温度23℃，时间48 h，过长时间产生假阳性太多。

4)覆盖筛选。培养基温度保持在50℃左右，以免烫死菌体。

在培养基中添加高浓度的铜离子(高于致死浓度)用于杀死未成功转化的菌株，同时也可以杀死非耐受的突变株，因此获得高耐受突变株的效率明显提升。同时研究表明，与某些金属离子如锌等不同，铜离子的对细胞毒性是不可逆的，如WT在CY培养基上铜离子的致死浓度是2.0 mM，在该浓度下，培养时间延长菌体也未见生长，因此，用含高浓度铜离子的培养直接覆盖不会诱导菌体的抗性而产生假阳性转化子。

通过该方法共获得15个高耐受铜突变株，铜吸附能力测定表明，其中一个突变株AT01铜吸附能力最高，每克菌丝吸附铜达到了12.73 mg，而WT仅为5.97 mg。吸附的最佳培养基初始pH值为5.0，培养最适温度为28℃。同时，研究表明，大量吸附铜离子后，木霉的菌丝颜色明显加深，这可以作为大量初筛选一个筛选指标，节省筛选周期。