肾上腺嗜铬细胞瘤VEGF和iNOS表达与临床特征的关系及相关性分析

高欣彤，史春玲，张 苗，龙兆博

嗜铬细胞瘤为起源于肾上腺髓质、交感神经节或其他部位嗜铬细胞的神经内分泌肿瘤，约80%～90%来自肾上腺，多为良性肿瘤[1]。本病临床较为少见，但由于其病理特征、围术期处理及预后等较其他肿瘤更为特殊，且从临床表现、实验室及影像学检查等方面难以区分良恶性，往往易延误患者治疗。近年大量研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与肾上腺嗜铬细胞瘤的发病有关[2-5]。为此，本研究选取我院存档的肾上腺嗜铬细胞瘤标本46例及正常肾上腺标本21例，探讨肾上腺嗜铬细胞瘤VEGF、iNOS表达与临床特征的关系及相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 肾上腺嗜铬细胞瘤标本：取自2010—2018年本院行手术治疗后存档的肾上腺嗜铬细胞瘤石蜡标本46例，均经病理检查确诊，具有完整的临床、随访资料。46例中男25例，女21例；年龄14～71(43.50±7.95)岁；单侧29例，双侧17例；良性28例，恶性18例。正常肾上腺标本：取自同时期意外死亡者尸检标本21例，男13例，女8例；年龄19～75(45.50±6.41)岁。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂：兔抗人VEGF抗体购自北京中山生物技术公司，一氧化氮合酶2一抗购自Santa Cruz公司，二抗和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.2.2 方法：组织切片常规脱蜡，冲洗后加3%过氧化氢处理以阻断内源性过氧化物酶活性，采用免疫组织化学染色两步法进行染色，严格按照试剂盒说明书进行操作。分别以已知肾上腺嗜铬细胞瘤VEGF和iNOS阳性结果作为阳性参考，以PBS液代替一抗、二抗结果作为阴性参考。

1.3 判别标准 以高倍显微镜下细胞质或细胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒沉着视为VEGF和iNOS阳性。每张切片随机选取10个视野，观察阳性细胞质表达强度并计算每个视野的阳性细胞数。无阳性细胞表示为“-”(阴性)，阳性细胞占比<15%、细胞着色呈浅棕色为“+”(弱阳性)，阳性细胞占比15%～60%、细胞着色呈棕黄色为“++”(阳性)，阳性细胞占比>60%、细胞着色呈棕褐色为“+++”(强阳性)。阳性表达率=(弱阳性+阳性+强阳性)例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法 应用SPSS 18.0软件处理数据。计数资料以率(%)描述，比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 正常肾上腺组织、良性及恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织VEGF和iNOS表达情况比较 VEGF、iNOS阳性表达率恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织>良性肾上腺嗜铬细胞瘤组织>正常肾上腺组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 正常肾上腺组织、良性及恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织中VEGF和iNOS表达情况比较[例(%)]

注：VEGF为血管内皮生长因子，iNOS为诱导型一氧化氮合酶；A、B、C分别为正常肾上腺组织、良性及恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织；与A比较，bP<0.01；与B比较，dP<0.01

2.2 VEGF表达与肾上腺嗜铬细胞瘤临床特征的关系 肾上腺嗜铬细胞瘤组织VEGF阳性表达率在性别、年龄、肿瘤侧别、术前血压方面无明显差异(P>0.05)；直径≥5 cm的肾上腺嗜铬细胞瘤组织VEGF阳性表达率明显高于直径<5 cm的瘤组织阳性表达率，恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织VEGF阳性表达率明显高于良性瘤组织阳性表达率，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 血管内皮生长因子表达与肾上腺嗜铬细胞瘤临床特征的关系[例(%)]

2.3 iNOS表达与肾上腺嗜铬细胞瘤临床特征的关系 肾上腺嗜铬细胞瘤组织iNOS阳性表达率在性别、年龄、肿瘤侧别、术前血压方面无明显差异(P>0.05)；直径≥5 cm的肾上腺嗜铬细胞瘤组织iNOS阳性表达率明显高于直径<5 cm的瘤组织阳性表达率，恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织iNOS阳性表达率明显高于良性瘤组织阳性表达率，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 诱导型一氧化氮合酶表达与肾上腺嗜铬细胞瘤临床特征的关系[例(%)]

2.4 VEGF和iNOS在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中表达的相关性分析 肾上腺嗜铬细胞瘤组织中VEGF和iNOS的表达呈正相关(r=0.452，P<0.001)。见表4。

表4 VEGF和iNOS在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中表达的相关性

注：VEGF为血管内皮生长因子，iNOS为诱导型一氧化氮合酶

3 讨论

肾上腺嗜铬细胞瘤属泌尿生殖系统肿瘤[6]，起源于肾上腺髓质，因其可释放大量儿茶酚胺，临床多表现为持续性或阵发性高血压、肾上腺皮质激素分泌增加等代谢紊乱症状[7-10]。因肾上腺组织学结构独特、生理功能特殊，若其发生病变，激素分泌紊乱，则难以维持机体正常的生理代谢[11-13]。但目前肾上腺嗜铬细胞瘤的发病机制、生物学行为等尚未明确，早期难以通过现有的临床检测手段明确其良恶性，发现为恶性时往往已进展到晚期。肿瘤复发或出现转移病灶可作为恶性嗜铬细胞瘤的确诊标准[14]。而肿瘤生长和转移的必要条件为新生血管生成，VEGF是目前发现的最强的血管通透性因子，在血管生成中发挥着重要的作用[15-16]。

VEGF可增加微血管的通透性，刺激血管内皮细胞增殖、移行，诱导新血管生成，对于肿瘤的生长、浸润和转移具有促进作用。大量研究表明，VEGF在多种恶性肿瘤尤其是出现浸润和转移的恶性肿瘤中表达率为80%以上[17-19]。一氧化氮(NO)是一种肿瘤启动剂，可损伤DNA、产生遗传毒性，导致肿瘤发生[20-21]。NO对肿瘤具有双重性，高浓度可引起细胞凋亡、抑制肿瘤生长，但适当浓度则有利于肿瘤生长。一般认为iNOS表达与肿瘤的生物学行为相关，iNOS活性上调后可引起NO合成增加至合适浓度，从而促进肿瘤生长。既往研究表明，在多种肿瘤中均存在VEGF和iNOS的高表达，二者呈正相关，在肿瘤发生发展、侵袭及转移的每个阶段均有联合作用[22-24]。VEGF介导溶解基质、新血管网构建和管腔形成等肿瘤血管形成过程与NO的关系密不可分，其可通过多种途径调节NO的释放。

本研究表明，VEGF和iNOS在正常肾上腺组织、良性肾上腺嗜铬细胞瘤组织、恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织中的阳性表达率分别为9.52%、46.43%、88.89%和4.76%、39.29%、83.33%，恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织VEGF和iNOS阳性表达率明显高于良性瘤组织和正常肾上腺组织中的阳性表达率，且VEGF和iNOS在直径≥5 cm、恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织中的阳性表达率明显高于直径<5 cm、良性瘤组织中的阳性表达率；相关性分析显示VEGF和iNOS在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中的表达呈正相关。由此可见，可通过检测VEGF和iNOS的表达来鉴别肾上腺嗜铬细胞瘤的良恶性，VEGF和iNOS共同促成了肾上腺嗜铬细胞瘤的发生、进展。

综上所述，VEGF和iNOS在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中的表达明显高于正常肾上腺组织，二者的表达与性别、年龄、肿瘤侧别、术前血压无关，而与肿瘤直径、良恶性相关，其在直径≥5 cm、恶性瘤组织中的阳性表达率明显高于在直径<5 cm、良性瘤组织中的阳性表达率，且二者表达呈正相关，共同影响肾上腺嗜铬细胞瘤的发生发展。