细胞周期因子Cdc 20对主动脉夹层诊疗价值

李 响，都珊珊

(1.吉林大学第一医院 干部病房，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 心血管外科)

主动脉夹层是较为罕见的一种致死性疾病，其发病急进展快，因急诊以胸痛症状为主要就诊原因的患者较多，通常会考虑急性心肌梗死或是肺栓塞、气胸等疾病，导致误诊从而耽误患者的诊疗过程[1]。目前针对主动脉夹层的特异性血清诊断标志物尚未出现[2]。现有研究证实Cdc20参与广泛疾病的细胞周期过程[3]，但其是否能够作为主动脉夹层的血清诊断标志物目前尚不明确。本文通过高通量生物信息学工具对基因芯片进行分析处理并通过主动脉夹层组织标本进行验证来明确Cdc20在主动脉夹层的诊疗过程中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2016年1月—2018年12月就诊于我院的主动脉夹层患者45例。所有患者均经主动脉CTA检查确诊为主动脉夹层Stanford A型患者。排除标准：①有昏迷、出血倾向等手术禁忌症患者，保守治疗及未行手术或拒绝治疗的患者。②遗传性主动脉夹层包括马凡综合征或特纳(Turner)综合征或埃-当(Ehlers-Danlos)综合征。其中男25例，女20例，平均年龄48.1±11.1岁。对照组为同期行冠状动脉旁路移植术患者经打孔器搜集的正常升主动脉组织41例。入组病例一般基本资料详见表1。本实验经吉林大学伦理委员会审核并批准，全部患者对手术标本去向及用途知情并同意将标本作为科研使用。

表1 2组患者一般资料比较

注：P均>0.05；表中数据以均数±标准差或例(%)表示

1.2 高通量生物信息分析方法编码RNA芯片表达结果GSE52093来源于GEO数据库(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。其中GSE52093包含7例主动脉夹层组织和5例捐献者正常的升主动脉组织。通过GEO2R软件进行差异表达统计分析，差异表达筛选标准为(差异倍数在2倍以上及P<0.05)。Graphpad prism 7进行差异基因的火山图绘制。STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行蛋白质互作网络分析，其中可信度分数定义在大于0.9为有意义改变。将STRING软件分析得到的高通量数据分析结果进行包括基因本体分析(GO analysis)和京都基因及基因组百科全书信号通路分析(KEGG analysis)。Cytoscape软件将STRING软件分析得到的结果进行共表达网络图绘制及cytoHubba关键基因的预测，筛选标准degree cutoff = 2,node score cutoff = 0.2,k-core = 2,and max depth = 100。

1.3全部患者升主动脉标本进行RNA提取(TIANDZ试剂盒)。RNA逆转录为cDNA采用All In One cDNA逆转录试剂盒。实时定量PCR操作仪器为ABI公司生产的7500 Real time PCR机器，每组样品均设3 个重复。Cdc20引物及GAPDH由Primer Blast设计，并经Oligo 7软件验证，引物序列：GAPDH(forward):CGGACCAATACGACCAA-ATCCG；GAPDH(reverse):AGCCACATCGCTCA-GACACC。Cdc20(forward):ATGCGCCAGAGGG-TTATCAG；Cdc20(reverse):AGGATGTCACCAGAGCTTGC。

2 结果

2.1芯片分析结果显示总共对47203个基因进行检测，其中43039个基因无明显变化，1866个下调差异性表达的基因，2288个上调差异性表达的基因。对上述数据进行火山图差异表达基因绘制，其中圆点代表无明显差异基因，圆圈代表差异上调基因，菱形代表差异下调基因，显示如图1。

2.2基因本体分析结果显示差异基因主要富集在细胞周期的调控和平滑肌细胞收缩功能，细胞成分主要富集在细胞外基质，分子功能富集在肌肉结构成分。京都基因及基因组百科全书信号通路分析显示差异性表达的基因主要涉及细胞周期和DNA复制。全部差异表达基因经STRING处理后得到的蛋白质网络互作分析数据，然后导入Cytoscape软件所得分析结果如图2，其中基因名称的大小以及基因所处背景大小根据蛋白网络互作分析结果中的Degree程度呈现渐进性改变。cytoHubba软件对全部差异表达的蛋白质网络互作分析结果进行进一步分析发现Cdc20为相关度最高的基因(dgree=37)。

图1 主动脉夹层组织与正常组织差异表达基因火山图

注：其中圆点代表无明显差异基因，圆圈代表差异上调基因，菱形代表差异下调基因。

2.3在获取的主动脉夹层和冠心病升主动脉组织中验证，Cdc 20 在2组织中均呈现差异性表达，RT-PCR检测结果发现 Cdc 20在夹层组和对照组之间呈现差异性高表达，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图2 差异表达基因蛋白质互作分析图

注：基因名称的大小以及基因所处背景大小根据蛋白网络互作分析结果中的Degree程度呈现渐进性改变，相关度评分越高，字体颜色越黑，蓝色背景越大。

3 讨论

主动脉夹层是血液通过内膜破口并在血压的驱动下进入血管内膜和中层之间而导致的一种撕裂样疼痛性疾病[4]。其临床多以胸部剧烈疼痛为首要就诊症状[5]。虽然胸痛三联检查冠状动脉-肺动脉-主动脉血管造影目前对主动脉夹层的检出率有所提高，但尚未在全部医院普及。血清学检查作为较为普遍、快速和廉价的检查方式之一在临床以及所有医院都能广泛应用。特别是血清学诊断标志物如心肌损伤标志物、脑钠肽、心肌酶学、D二聚体[6]等在心肌梗死、心衰、血栓性疾病的诊断上有独特优势，但目前尚无主动脉夹层的特异性血清诊断标志物应用临床。

图3 RT-pcr检测Cdc 20在夹层组及对照组织的表达量

研究发现，在一些疾病的发展早期，存在于正常组织和病变组织中的RNA已经发生改变，对这些特定的RNA检查能够起到早期的诊断作用，甚至可以进行特定的干预来预防疾病的发生和发展[7]。因此越来越多的研究将主动脉夹层的早期血清诊断标志物作为研究的热点，也发现了较多的具有诊断价值的RNA诊断标志物。但是高通量数据分析也会出现许多错误的生物学信息，需要不断的进行分析来排除干扰并需要经过组织学验证。故本文在前人基因芯片结果的基础上进行进一步的高通量生物信息学分析及组织标本验证，来明确Cdc20在主动脉夹层中的诊疗价值。

通过对GSE52093基因芯片中差异性表达的基因进行分析发现，主要的差异基因汇集在平滑肌细胞的增殖及细胞周期调控方面。进一步将全部的差异表达基因进行STRING分析得到蛋白共表达网络分析数据后，在对这些数据进行cytoHubba分析后发现Cdc20为最为关键的差异基因，而细胞周期为最关键的信号通路。Cdc20是最早发现的细胞周期因子之一，其主要功能是通过调节细胞周期蛋白B(Cyclin B)和细胞周期调控因子p21来影响细胞周期,并能影响Wnt/β连环信号传导通路和Nek2A以及Kif18A通路。Cdc20同时还能耗尽内源性phf8从而导致细胞G2周期的延长而使有丝分裂缺陷最终影响细胞周期[8]。而已有大量研究指出平滑肌细胞的增殖周期以及迁移能力的改变是主动脉夹层的重要发病机制。而我们的研究和既往文献结果均确认平滑肌细胞的增殖周期在主动脉夹层的发病过程中起到主要作用，并且通过组织标本验证Cdc20在主动脉夹层的升主动脉组织中均呈现差异性表达，具有一定的可信度。

总之，Cdc20作为细胞周期通路中的关键因子，在主动脉夹层的诊断中具有潜在诊疗价值。针对Cdc20不仅能对主动脉夹层的诊断起到提示作用，对其早期检测，更可能对主动脉夹层易感人群进行筛查，从而制定降压等干预措施达到早期诊断及治疗的效果。