金刚藤对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

文一惠，凌江红，，丛军，李莉

1广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2上海中医药大学附属曙光医院

原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤。原发性肝癌中最为常见的是肝细胞肝癌(HCC)，占80%～90%[1]。目前，HCC的治疗主要有外科手术、消融治疗、介入治疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗、中医药治疗等。在HCC发病早期，首要治疗手段是肝脏切除，但大部分HCC临床确诊时已达中晚期，仅有20%的HCC患者有机会接受手术治疗，术后仍有肿瘤复发、转移等不利因素[2，3]。消融治疗、介入治疗是基于肿瘤定位及较小肿瘤有效的治疗手段。大部分传统化疗药不良反应较多，易产生耐药[4，5]。而靶向治疗及免疫治疗存在个体差异，且费用高昂。因此，寻找疗效稳定且不良反应小的治疗药物有重要意义。金刚藤为百合科菝葜属植物的干燥根茎，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功效，临床上常用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、盆腔炎等疾病。本课题组前期研究发现金刚藤具有良好的抗肿瘤作用[6]。2019年1～8月，本研究观察了不同浓度金刚藤对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，进一步探讨金刚藤的抗肝癌作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞及主要材料 SPF级SD大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证编号为SCXK(沪)2018-0004，雌雄不限，鼠龄8～10周，共16只。大鼠适应性喂养7 d后用于实验，喂养期间大鼠自由进食、水。人肝癌SMMC-7721细胞株由上海中科院细胞库提供。将SMMC-7721细胞按1×106/板接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、恒温恒湿条件的细胞培养箱中培养，1～2 d换液传代1次。待细胞进入对数生长期后进行实验。中药金刚藤购自广西民族医药研究所，产地广西，批号为161201，由桂林鼎康中药饮片有限公司生产。DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗混合液、胎牛血清购自美国GIBCO公司。Apoptosis Detection Kit购自上海翊圣生物科技有限公司。CO2培养箱购自美国Thermo公司。多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司。流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 金刚藤水煎液及含药血清的制备 ①金刚藤水煎液的制备：200 g金刚藤饮片，加水至高出药物表面2～3 cm处，浸泡2 h武火煮沸后改用文火煎煮30 min，冷却，过滤取汁(滤液1)，滤渣如上法再煎2次，得到滤液2、滤液3，混合3次得到的药液，浓缩至100 mL，得到2 g/mL的药液，4 ℃保存备用。②含药血清的制备：SPF级SD大鼠16只，随机分为空白组(Control组)、金刚藤低剂量组(JGT-L组)、金刚藤中剂量组(JGT-M组)和金刚藤高剂量组(JGT-H组)，每组4只；JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组大鼠分别以0.5、1、2 g/mL的金刚藤水煎液灌胃、每次4 mL，Control组给予等体积生理盐水灌胃，每天灌胃2次、间隔12 h，连续给药3 d；末次给药1 h后以CO2窒息法处死小鼠，心脏取血，静置后离心15 min取血清，合并同组血清，过滤、灭活除菌后得到含药血清，-80 ℃冻存备用。

1.3 细胞分组及给药方法 取对数生长期SMMC-7721细胞分为Control组、JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组，用DMEM培养液调整细胞浓度为1×105/mL，加入96孔培养板、每孔0.1 mL，在37 ℃、5% CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁达到70%～80%时，弃去细胞培养液。JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组、Control组分别加入0.5、1、2 g/mL的含药血清4 mL和等量生理盐水。

1.4 细胞增殖能力观察 分别于培养12、24、48 h后行CCK-8实验。每组重复6个副孔，每孔分别加入10 μL的CCK-8，继续置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育3 h。用酶标仪测定450 nm波长处各孔的光密度值(OD值)，表示细胞增殖能力。

1.5 细胞凋亡率测算 培养24 h后收集细胞，1 000 r/min离心5 min，去除培养基。用PBS清洗1次后，空白血清组重悬于1×Binding Buffer(400 μL)，金刚藤含药血清组重悬于1×Binding Buffer(100 μL)中。取出100 μL上述溶液至流式管中，分别加5 μL的FITC-Annexin Ⅴ和5 μL的Propidum Iodide。轻柔弹起混匀，室温(25 ℃)避光孵育15 min。向每管中加入400 μL的1×Binding Buffer，混匀。1 h内上流式细胞仪检测，并计算细胞凋亡率。

1.6 细胞周期检测 培养24 h后收集细胞，1 000 r/min离心5 min，去上清。用PBS洗2次，边振荡边加-20 ℃预冷的70%乙醇1 mL，4 ℃固定30 min或-20 ℃固定过夜，直至进行DNA染色。染色时取出标本，于1 000 r/min离心5 min，将乙醇吸除，加PBS清洗固定液1～2次后，1 000 r/min离心5 min，弃上清。吸除离心管内PBS，加入200 μL的PBS和2 μL的RNA酶(0.25 mg/mL)，37 ℃孵育30 min，加入PI(50 μg/mL)5 μL室温(25 ℃)避光反应30 min。用流式细胞仪检测并分析细胞周期。

2 结果

2.1 金刚藤对SMMC-7721细胞增殖的影响 各金刚藤药物组相同作用时间下细胞增殖能力均低于Control组(P均<0.05)；JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组细胞增殖能力逐渐减弱，组间两两相比，P均<0.05。见表1。

表1 各组SMMC-7721细胞增殖能力比较

注：与同时点Control组比较，*P<0.05；与同时点JGT-L组比较，#P<0.05；与同时点JGT-M组比较，△P<0.05。

2.2 金刚藤对SMMC-7721细胞凋亡的影响 Control组、JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组细胞凋亡率分别为5.48%±0.13%、6.86%±0.69%、8.75%±0.22%、9.80%±0.35%。各金刚藤药物组细胞凋亡率均高于Control组(P均<0.05)；JGT-L组、JGT-M组、JGT-H组细胞凋亡率逐渐升高，两两相比，P均<0.05。

2.3 金刚藤对SMMC-7721细胞周期的影响 JGT-M组、JGT-H组G0/G1期细胞比例高于Control组(P均<0.05)；JGT-L组S期细胞比例高于Control组，JGT-M组、JGT-H组S期细胞比例低于JGT-L组，JGT-H组S期细胞比例低于Control组(P均<0.05)；JGT-L组、JGT-M组G2/M期细胞比例低于Control组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组SMMC7721细胞周期分布比较

注：与Control组比较，*P<0.05；与JGT-L组比较，#P<0.05。

3 讨论

金刚藤味微辛，性温，归肝肾经，可以利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀，治疗风湿关节痛、跌打损伤、盆腔炎等。近年来发现，金刚藤对肿瘤具有很好的抑制作用，在临床上取得了一定疗效。王静等[7]发现，复方菝葜颗粒联合髂内动脉栓塞灌注化疗治疗局部晚期宫颈癌疗效较好，可有效减少不良反应，增强患者免疫功能。有学者[8，9]发现复方菝葜颗粒治疗中晚期非小细胞肺癌有一定疗效，有望延长肺癌患者的生存期，提高生活质量。另外，还有多项基础研究证实了金刚藤的抗肿瘤作用。Nambiar等[10]发现，金刚藤的成分水飞蓟宾能使肿瘤细胞发生G1期阻滞、诱导细胞凋亡，从而发挥抗胰腺癌活性。Fu等[11]研究表明，金刚藤可通过线粒体途径诱导人肺腺癌A549细胞凋亡。Yu等[12]发现金刚藤的甲醇提取物能够通过ERK途径诱导人口腔癌MC-3细胞凋亡。本课题组前期检测10种壮药含药血清对SMMC-7721细胞生长的抑制情况，观察到金刚藤、藤梨根、叶下珠、半枝莲可抑制肝癌细胞增殖，其中金刚藤对SMMC-7721细胞抑制作用最强[6]。所以,本实验以SMMC-7721细胞为研究对象，观察金刚藤对其增殖、凋亡及细胞周期的影响。

一系列基因精密调控着细胞的增殖，失去基因的正常调控后，细胞可无限增殖，导致肿瘤的发病[13]。抑制肿瘤细胞增殖，能够延缓肿瘤的发展和转移。吴先闯等[14]采用MTT法检测菝葜提取分离的乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对肝癌细胞H22、HepG-2、BEL-7402体外生长抑制情况，结果显示4种提取部位均有不同程度的抗肝癌细胞活性，其中乙酸乙酯部位抑制细胞增殖活性最强，呈现剂量依赖性。本研究结果显示，金刚藤对SMMC-7721细胞增殖有明显的抑制作用，随着金刚藤浓度增加，其抑制效果更显著，与相关研究结果一致。

细胞凋亡是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程，是机体维持生理活动所必需的。细胞凋亡障碍会诱导肿瘤的发生发展[15]。Hu等[16]研究表明，金刚藤可通过激活Caspase-3、PARP和Bax诱导细胞凋亡，抑制NF-κB的核转录，下调Bcl-2、Bcl-XL、cIAP-1、XIAP和AKT表达，诱导卵巢癌A2780细胞凋亡。廖子君等[17]发现菝葜皂苷能够上调胃癌BGC-823细胞Bax蛋白水平、下调Bcl-2蛋白水平，从而诱导其凋亡。何萍等[18]研究显示，菝葜、红藤、藤梨根三药联合使用可增强对人胃癌SGC-7901细胞的抗癌作用，可能与活化Caspase-3有关。本研究结果显示，金刚藤对SMMC-7721细胞具有凋亡诱导作用，随着金刚藤浓度增加，SMMC-7721细胞凋亡率逐渐增高，证实了金刚藤可诱导肝癌细胞凋亡。

肿瘤的发生发展不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，也与细胞周期关系密切。细胞周期的调控在肿瘤发生发展过程中同样起着关键作用。细胞周期调控紊乱将导致细胞恶性转化和肿瘤细胞失控性增殖[19]。于丽秀等[20]观察了菝葜对乳腺癌A2780、HO8910PM细胞存活的影响，发现菝葜的对两种卵巢癌细胞均有抑制作用，抑制作用呈剂量及时间依赖性。有研究发现金刚藤的成分水飞蓟宾能使胰腺癌细胞阻滞于G1期[10]。本研究采用流式细胞仪检测细胞周期，结果显示，金刚藤对SMMC-7721细胞周期具有阻滞作用，其中JGT-M组、JGT-H组主要将细胞阻滞在G1期，提示金刚藤可调控肝癌细胞周期，这与相关研究[10]结果一致。

综上所述，金刚藤可抑制SMMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞于G0/G1期，相关机制仍有待进一步深入研究。