燕麦耐盐性的生理生化指标网络分析

赖弟利 范 昱 朱红林 何 凤 梁 勇 徐欣然 文 杰 王俊珍 严 俊 程剑平

（1贵州大学麦作研究中心，550025，贵州贵阳；2成都大学药学与生物工程学院/农业农村部杂粮加工重点实验室，610106，四川成都；3凉山州西昌农业科学研究所，615000，四川凉山）

盐碱胁迫是影响植物生长发育，导致产量和品质下降的主要非生物逆境因素之一，也是目前制约农作物产量增加的主要逆境因素之一[1-2]。全世界约有9.6亿hm2盐碱地，其中我国约有3 300万hm2，约占全世界盐碱土地的1/28，在全球气候变化的背景下，土壤盐渍化的威胁日益加剧[3]。世界上约有20%的耕地受盐渍化影响，土壤盐渍化导致约50%的作物产量损失[4]。土壤中的致害盐类以中性盐NaCl为主，对于大多数生长在盐碱土生境中的植物来说，它们要遭受Na+毒害[5]。燕麦是禾本科（Gramineae）燕麦属（Avena）一年生草本植物，又称筱麦、玉麦和铃铛麦[6]。燕麦不仅是特色粮饲兼用作物，还是绿色营养保健作物[7]。与传统栽培作物小麦（Triticum aestivum）等相比，燕麦具有更强的抗逆性[7-8]，特别是对盐碱土表现出良好的适应性，被认为是盐碱地改良的重要替代作物之一，在许多国家倍受重视并广泛栽培[9]。燕麦丰富的基因资源还可用于温带禾谷类和牧草的改良，以及未来禾草类植物再生能源相关性状的生物学认识研究[10]。

目前，有关燕麦耐盐性的研究取得了一些进展，李倩等[11]的研究结果表明燕麦根、茎、叶随盐胁迫程度的增加Na含量基本呈增加趋势；也有研究[12]发现低盐浓度适宜各类燕麦生长，且对较耐盐品种有促进萌发和生长的作用。Bai等[13]研究发现盐胁迫和碱胁迫的症状有所不同，碱胁迫主要降低叶绿素含量，而盐分主要破坏水吸收。并且不同盐碱胁迫处理对燕麦种子萌发的影响存在差异，土壤浸提液处理对燕麦种子萌发的影响要强于土壤处理[14]。付鸾鸿等[15]对燕麦萌发期耐盐碱性鉴定指标的筛选结果表明，发芽势、胚根鲜重、胚根长对燕麦盐碱胁迫耐性影响明显，可用于盐碱胁迫耐性的评价。刘勇等[16]和蔡天革等[17]研究发现，盐胁迫下燕麦种子发芽率、发芽势和活力指数随盐浓度的增加均呈下降趋势；超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性随盐浓度的增加而上升。研究[18-19]表明脯氨酸的积累与植物耐盐程度呈负相关关系；El-Samad等[20]发现，作物耐盐品种体内可溶性蛋白质含量较高，而盐敏感品种则较低。此外，在燕麦耐碱方面的研究也取得一定进展，碱胁迫后燕麦根的生长受到的抑制比芽生长受到的抑制更大[21]。Bai等[22]发现在碱性胁迫下，籽粒灌浆期丙二醛含量与可溶性糖含量呈正相关，耐碱基因型在抽穗期表现为较高的抗氧化酶活性和较低的可溶性糖含量，并且丙二醛含量低于碱敏感基因型。但对于燕麦幼苗苗期内耐盐指标与生理生化指标的相关性研究还较少。为此，本研究采用6个栽培燕麦品种为材料，以沙培法研究不同浓度盐胁迫及不同生长时间下燕麦幼苗生长及生理生化指标的影响，揭示耐盐性与生理生化指标的相关性，探寻燕麦幼苗抗盐生理机制与规律，以期为燕麦抗盐育种提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试燕麦种子由西北农林科技大学胡银岗教授提供。本研究组前期经种子盐胁迫垂直萌发法[23]和燕麦幼芽在NaCl溶液生长初步筛选出具有一定耐盐性的TO31、TO48、TO53、白燕6号（BY6）、白燕9号（BY9）和冀张莜4号（JZY4）品种（表1）。

表1 燕麦材料基本情况Table 1 Basic situation of oat materials

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 试验于2018年在成都大学进行。河沙先用自来水洗9～10次，基本洗净后，再用纯净水浸洗2次，每次浸泡1h，每隔15min翻动沙子1次，取第2次浸出液以1∶100（1mL浸出液加入100mL纯净水）稀释后，测定其电导率，与纯净水电导率进行比较（纯水电导率：0.75 μ S/cm，河沙浸出液电导率：9.65 μ S/cm），水温为23.7℃，当河沙中的离子浓度等可忽略不计后，晾干备用。从6个燕麦品种中选取大小一致、籽粒饱满的种子各600粒，置于培养皿（直径100mm）中，用纯净水浸种12h，待种子萌发备用，处理方法参考李倩等[11]和武俊英等[23]试验。

1.2.2 试验设计 采用双因素试验设计并结合沙培盆栽法进行试验[11，23]，品种6个，盐浓度5个，依次为1、2、4、6、8g/kg NaCl（分析纯），以无盐胁迫为对照（CK），共6个处理。称取来富利牌复合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）0.5g/kg，分别与 6 个处理的盐沙混合均匀。从盆中取出厚度约0.7cm的混合沙，挑选浸种后胚根突破种皮且基本一致的种子播种到对应花盆，用取出的沙均匀覆盖种子，每盆30粒；每个处理3盆，3个重复，共108盆。每天早晨9∶00喷洒1.5～3.0L的纯净水，每5d用10mL纯净水将托盘浸洗1次，并将浸洗液洒到对应盆中。

1.3 测定项目

分别在播种7、14和21d测定相应植株的生长及生理生化指标，每次随机取样15株苗。用刻度尺测量主根根长求平均值和苗高；根数以胚根形成的主根为标准进行统计；存活率=存活种子数/供试种子总数×100%，以根长与芽长之和大于等于1.0cm为存活标准，该存活率只针对燕麦幼苗期有效，可称为阶段性存活率。

用叶绿素测定仪（SPAD-502 PLUS）测定叶片叶绿素含量[24]，由于播种7d时燕麦叶片尚未抽出，仅测定播种14和21d的SPAD值；采用茚三酮比色法测定脯氨酸（Pro）含量[25]；采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）活性[25]；采用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛（MDA）含量及可溶性糖（SS）含量[25]。

1.4 数据统计分析

用JMP 6.0软件进行方差、品种指标平均值差异显著性（P＜0.05）Tukey-Kramer HSD检验及正态分布检验；用R-2.11构建籽粒相关性状间的Pearson相关性矩阵，并由Cytoscape 2.7.0对相关性矩阵进行相关性网络分析[26]。

将盐胁迫处理下测得的生长指标平均值与无胁迫处理的平均值相除，得出相对值，此相对生长指标作为燕麦幼苗耐盐性指标，以相对生长指标评价燕麦幼苗的耐盐性大小，以期更加准确地反映各品种的耐盐性差异[27-28]。采用模糊综合评判法计算各燕麦品种的隶属函数值X(u)=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin），式中：X(u)表示该指标的隶属值，X为各燕麦某一指标的测定值，Xmin为该指标测定值的最小值，Xmax为该指标测定值的最大值[29]。

2 结果与分析

2.1 不同生长时间及盐浓度对燕麦幼苗相对生长指标的影响

随盐浓度的增加，相对苗高均呈下降趋势（图1A）。各品种的相对苗高在1g/kg盐浓度下都大于1.0，表明1g/kg盐浓度对苗高的增长有促进作用；≥2g/kg盐浓度时，各品种相对苗高均小于1.0，苗高的增长受到盐胁迫作用。除BY6和BY9外，其余品种的相对苗高在盐浓度≤2g/kg时随生长时间的增加呈先增加后降低趋势；各品种的相对苗高在盐浓度≥4g/kg时随生长时间的增加而降低。

相对根长均随盐浓度的增加呈下降趋势（图1B）。在1g/kg盐浓度下，除TO53的相对根长在3个时间段都大于1.0外，其余品种在播种14或21d时大于1.0；在2～8g/kg盐浓度下，各品种相对根长均小于0.6，且各品种的相对根长均在1～2g/kg盐浓度时下降最为显著，表明根长对盐胁迫较为敏感。此外相对根长在1～2g/kg随生长时间的增加呈增加趋势，但在4～8g/kg随生长时间的增加而降低。

相对存活率随盐浓度的增加均呈下降趋势（图1C）。播种7d时，各品种的相对存活率随盐浓度增加下降趋势较为明显，下降幅度较大；播种14d时，TO48的相对存活率随盐浓度增加持续下降，但TO53、BY6和BY9的相对存活率在1～6g/kg下降趋势不明显。播种21d时，除TO48的相对存活率随盐浓度增加仍持续下降外，其余品种的下降趋势较为平缓，且在1～6g/kg的下降幅度不明显。各品种相对存活率在盐浓度为1g/kg的均大于1.0，表明1g/kg盐浓度有助于幼苗存活。

图1 不同盐浓度、生长时间下6个燕麦品种幼苗相对生长指标Fig.1 Relative growth indexes of seedlings of six oat varieties under different salt concentrations and growth time

如图1D所示，播种7d时，除TO48外，其余品种的相对根数在1～2g/kg盐浓度无变化；各品种相对根数均在4g/kg盐浓度有增加趋势，其中TO31、TO48和BY6在4g/kg时达最大值，其他品种在6g/kg时达最大值。播种14d时各品种的相对根数随盐浓度增加基本能保持稳定；播种21d时各品种的相对根数随盐浓度增加呈下降趋势。除播种21d，8g/kg盐浓度下TO48、BY9和JZY4的相对根数小于0.6外，其余时段、盐浓度下各品种的相对根数均大于0.6。除TO31外，各品种的相对根数在2～8g/kg随生长时间的增加呈下降趋势。

2.2 品种、生长时间和盐浓度对燕麦幼苗耐盐指标的影响

由表2可知，品种、生长时间和盐浓度均对燕麦幼苗的相对存活率、相对根数和相对苗高产生极显著影响（P＜0.001），并且三因素两两之间及三者之间相互作用对幼苗相对存活率、相对根数和相对苗高产生极显著影响（P＜0.001）。另外生长时间对燕麦幼苗的相对根长产生显著影响（P=0.019），而品种和盐浓度均对燕麦幼苗相对根长产生显著影响，三因素两两之间及三者之间相互作用对幼苗相对根长产生极显著影响（P＜0.001）。三因素方差分析其结果表明，品种、生长时间及盐浓度三因素无论是单独或是交互作用均对燕麦幼苗耐盐指标产生显著或极显著影响，说明在进行不同品种燕麦耐盐性评价时，需要将盐浓度及生长时间结合起来，才能更为客观地对不同品种幼苗耐盐性进行较为准确的评价。

表2 品种、生长时间、盐浓度对燕麦幼苗耐盐指标的影响Table 2 Effects of varieties, growth time and salt stress levels on salt tolerance indexes of oat seedlings

2.3 燕麦幼苗生理生化指标差异分析

图2 不同盐浓度、生长时间下6个燕麦品种幼苗生理生化指标Fig.2 Physiological and biochemical indexes of six oat varieties seedlings under different salt concentrations and growth time

从图2可以看出，在盐胁迫下各品种间生理生化指标随盐浓度、时间的变化是极为复杂的，6个燕麦品种的相对MDA和相对Pro含量随盐浓度的增加总体呈先上升后下降趋势，品种间相对SS含量变化趋势存在差异，相对POD活性和相对SPAD值总体而言随盐胁迫的增加呈先增加后减小的趋势。播种7、14d时，BY6和BY9的相对MDA含量总体较低，TO48和JZY4的相对MDA含量总体较高；而在播种21d且盐浓度大于2g/kg时，BY6和BY9的相对MDA含量较TO48和JZY4的高。就Pro而言，TO53的相对Pro含量在播种7和14d总体水平较高，BY9和TO48的在播种7和14d水平较低；播种21d时，BY9较高，BY6和TO48较低。BY9的相对SS含量在播种7、14d时总体水平较低，而JZY4较高；但在播种21d且盐浓度大于2g/kg时，BY6的相对SS含量总体较高，TO48较低，此外BY9的相对SS含量显著高于TO31、TO48、TO53。对于相对POD活性和相对SPAD值而言，各品种间的差异较为明显，其中BY6的相对POD活性总体较高，而TO48的相对POD活性总体较低；在相对SPAD值中可以看出，TO48的相对SPAD值明显要低于其他品种。

2.4 燕麦幼苗的耐盐指标、生理生化指标及种子千粒重之间的网络相关性分析

耐盐指标与生理生化指标及种子千粒重之间经Pearson相关性分析，构建相关性矩阵，并对矩阵中的相关性进行显著性检验（P＜0.05），删除不显著的相关性后，并用其作为网络关系间的连接（Edge），将正相关与负相关分别用实线和虚线表示。

耐盐指标与生理生化指标及种子千粒重相关分析（图3）显示，燕麦幼苗相对存活率、相对苗高、相对根数和相对根长两两之间均呈显著正相关关系；相对存活率、相对苗高和相对根数均与POD活性和SPAD值之间均存在显著正相关，而相对根长与POD活性和SPAD值之间无显著相关性；相对苗高、相对根长、相对存活率和相对根数均与MDA含量和Pro含量之间存在显著负相关；此外SS含量仅与相对苗高、相对根数之间存在显著负相关，与相对根长、相对存活率之间无显著相关关系。耐盐指标与生化指标之间存在显著或极显著相关关系，说明进行燕麦耐盐性评价时不仅需要考虑品种、盐浓度及胁迫时间，还需结合盐胁迫下幼苗的生理生化指标才能更为全面评价其耐盐性。

图3 燕麦幼苗耐盐指标与生理生化指标及种子千粒重之间的相关性网络Fig.3 Correlation network among salt tolerance indexes,physiological and biochemical indexes and 1000-seed weight of oat seedlings

MDA、Pro和SS含量两两之间均呈显著正相关，且相关系数较高；另外，本研究发现，POD活性仅与SPAD值呈显著正相关关系，且具有较大的相关系数，而与其他生理指标间无显著相关关系；SPAD值和MDA、SS含量之间存在显著负相关关系，说明MDA、SS含量增加时，SPAD值会下降。结果显示，种子千粒重与燕麦幼苗相对存活率、相对根数、相对苗高、POD及SPAD值之间存在显著负相关关系，说明重量较小的种子所萌发的幼苗更有利于在盐胁迫条件下生存。

2.5 燕麦幼苗耐盐性综合评价

由图3相关性网络可知，不同盐浓度处理下，幼苗相对生长指标（相对苗高、相对根长、相对存活率、相对根数）与生理生化指标间存在显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）相关，说明这些指标可用于评判燕麦耐盐性。从表3可以看出，BY6的隶属函数平均值最大，为0.6010，表明BY6的耐盐性在6个品种中最强；而TO48的隶属函数平均值为0.4681，在6个品种中处于最低值，因此TO48的耐盐性应该是最弱的。品种间的耐盐性排序为BY6＞BY9＞TO31＞TO53＞JZY4＞TO48。

表3 各品种的隶属函数值Table 3 Subordinate function value of each variety

3 讨论

本研究发现，相对株高、相对根长和相对存活率均随盐浓度增加而降低，这与前人[23，28，30]对燕麦耐盐性研究结果一致。2～8g/kg盐浓度下，各品种相对根长均小于0.6，说明燕麦幼苗的根长对盐胁迫尤为敏感。燕麦的相对根长在4～8g/kg随生长时间的延长而降低，但在1～2g/kg随生长时间的延长呈增加趋势，说明尽管盐浓度过高时根长生长受到明显抑制，但低盐浓度下燕麦幼苗能自我调节而抵抗盐胁迫。相对存活率虽然随盐浓度的增加呈下降趋势，但随生长时间的延长更多品种能保持存活率相对稳定，这可能是幼苗对盐胁迫的积极响应。有研究[30]表明相对根数随盐浓度增加而降低，也有研究[28，31]表明相对根数随盐浓度增加先增加后降低，本研究结果与前者存在一定差别，但与后者结果类似。此外本研究发现，幼苗通过增加根数抵御盐胁迫能力有限，仅在播种7d时能增加根数来抵御盐胁迫，播种14d时保持稳定，播种21d时随盐浓度增加而减少。多数时段及盐浓度下相对根数均大于0.6，这可能是燕麦幼苗根的数目对其抵御盐胁迫至关重要，即使在高浓度下仍然保持较多的根数以维持生存。

郑洪亮[32]利用连锁与连锁不平衡联合作图对粳稻耐盐性遗传位点解析发现，芽期与幼苗前期的相对发芽率、相对苗高、相对根数和相对根长耐盐相关性状对盐胁迫的反应存在较强的协同变化，即燕麦幼苗相对存活率、相对苗高、相对根数和相对根长两两之间均呈显著正相关关系，本研究结果与其相似。水分胁迫下，POD活性越高植物抗旱耐盐性越强[33]，前人对小麦[34]、黄瓜[35]、土豆[36]等的研究认为，抗氧化酶活性高的种质耐盐能力强。POD可清除逆境胁迫产生的H2O2，是细胞抗氧化酶系统的成员之一。并且贺岩等[37]的研究也表明小麦POD活性随盐浓度增加而增加，品种间存在差异，耐盐品种高于盐敏感品种，这与本研究结果类似。本研究发现，POD活性和SPAD值均与相对存活率、相对苗高和相对根数之间均存在显著正相关，并且耐盐品种BY6的相对POD活性总体较高，而耐盐性最弱的品种TO48的相对POD活性以及SPAD值总体较低，表明POD活性和SPAD值与幼苗耐盐性大小呈正相关，因此在盐胁迫下可能耐盐品种产生的POD活性较高、SPAD值较大。

前人[38-40]研究结果表明，MDA、Pro的积累规律与品种的耐盐能力具有相关性，可作为品种是否耐盐的判定指标。并且对于植物盐胁迫下MDA、Pro活力与耐盐能力相关性的研究也较多，对于老芒麦[41]、小黑麦[42]、小麦[43]的研究结果一致表明耐盐能力强弱与盐分处理下MDA含量呈现负相关，MDA含量增加较少的品种，耐盐性较好，所以对于MDA含量与耐盐能力相关性的争议较少。在本研究中，燕麦幼苗在盐胁迫下MDA含量与相对苗高、相对根长、相对存活率和相对根数之间存在显著负相关关系，耐盐品种BY6和BY9的相对MDA含量在播种14和21d总体水平较低，耐盐性差的品种TO48和JZY4的相对MDA含量在播种7、14d时整体水平上较高。因此MDA含量与幼苗耐盐性大小呈负相关，耐盐品种在盐胁迫下产生的MDA含量较少。而对于Pro含量与耐盐能力相关性存在一定争议，因为前人对小麦[34]、小黑麦[42]、黑麦草[44]等的研究认为耐盐性好的品种Pro含量高，但对偃麦草[45]、高粱[46]的研究认为耐盐性高的品种在盐胁迫下Pro含量低。本研究中Pro含量的变化情况也未完全与耐盐性同步，其中耐盐品种BY9在播种7和14d总体水平低于其他品种，但在播种21d时却较高；而网络相关性结果表明Pro含量与相对苗高、相对根长、相对存活率和相对根数之间存在显著负相关关系，故Pro含量可能与幼苗耐盐性大小呈负相关，说明耐盐品种在盐胁迫下可能产生较少的Pro。

本研究发现，SS含量与相对苗高、相对根数之间存在显著负相关，这与SS含量的变化情况也基本相符，即播种7、14d时耐盐品种BY9的相对SS含量在总体水平较低，而JZY4较高；在播种21d且盐浓度大于2g/kg时，BY6的相对SS含量总体较高，TO48较低，表明SS含量与耐盐性呈负相关，耐盐品种在盐胁迫下可能产生较少的SS。MDA、Pro和SS含量两两之间均呈显著正相关；前人[47]对木本植物的研究表明POD活性与游离Pro含量存在显著正相关性，但本研究中POD活性仅与SPAD值呈显著正相关关系，与Pro含量不存在显著相关关系，虽然这与本研究结果存在差别，但这可能是木本植物与燕麦耐盐机制不同的缘故；SPAD值和MDA、SS含量之间存在显著负相关关系，说明盐胁迫下MDA、SS含量增加时，SPAD值会减小，这也许是细胞膜被氧化损伤所导致。此外本研究还发现种子千粒重与相对存活率、相对根数、相对苗高、POD活性及SPAD值之间均存在显著负相关关系，说明千粒重更小的种子，其幼苗在盐胁迫下可能产生更多POD活性及SPAD值，因此有更高的相对存活率、相对根数、相对苗高，从而具有更强的盐胁迫适应能力，有利于幼苗在盐胁迫下存活，但其具体生理生化机制还有待深入研究。

4 结论

通过分析盐胁迫下燕麦幼苗的耐盐性指标与生理生化指标的相关性发现，过氧化物酶活性、叶绿素含量与燕麦幼苗耐盐性呈正相关，丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量与幼苗耐盐性呈负相关，种子千粒重与耐盐指标过氧化物酶活性及叶绿素含量之间存在显著负相关关系。