高粱硬脂酰-ACP脱氢酶基因（SbSAD）家族鉴定及不同发育阶段表达分析

赵训超 徐晶宇 盖胜男 魏玉磊 许晓萱 丁 冬 刘 梦 张今杰 邵文静

（黑龙江八一农垦大学农学院/黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室，163319，黑龙江大庆）

高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]属于禾本科一年生草本植物，具有很高的光合效率。高粱可以食用、饲用，还可作为工业原料；高粱籽粒中含有较高的蛋白质、淀粉、脂肪酸等[1-2]。高粱是重要的酿酒原料[3-5]。高粱籽粒中脂肪酸可以丰富酒体的香味，其中脂肪酸包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，高粱脂肪酸中不饱和脂肪酸含量在82%左右，不饱和脂肪酸对人体非常有益[5]。硬脂酰-ACP脱氢酶（SAD）是催化饱和脂肪酸形成不饱和脂肪酸的关键酶，使细胞膜的流动性增强，进而可提高农作物抗逆能力。因此，对SAD基因家族的研究有助于提高植物的抗逆能力。

不饱和脂肪酸主要包括油酸、亚油酸和亚麻酸等。高粱不饱和脂肪酸中油酸含量在30%左右，亚油酸和亚麻酸含量在50%左右[5]。油酸是植物和动物生物膜中甘油磷脂的主要成分，并且是合成亚油酸的前体，是决定脂肪酸不饱和程度的关键[6]。在植物中，脂肪酸的从头合成途径主要发生在质体中，该过程使用乙酰辅酶A作为底物，并依赖酰基载体蛋白（ACP）的参与[7]。在脂肪酸合酶复合物（FAS）的催化下，丙二酰辅酶A与ACP结合，酰基链每个循环经历2个碳原子形式的连续缩合反应，产生 16∶0-ACP和 18∶0-ACP[8]。SAD 催化18∶0-ACP在Δ9位置去饱和作用形成18∶1-ACP，这是调节细胞中不饱和脂肪酸水平的关键步骤[9]。催化得到的18∶1-ACP可以进入原核甘油脂途径，或被水解成游离脂肪酸并输出到胞质溶胶中，进而活化成脂酰辅酶A用于三酰基甘油（TAG）和内质网中的磷脂合成[10]。

SAD通过在C9和C10位置插入双键催化饱和脂肪酸脱氢生成不饱和脂肪酸。目前，在拟南芥[11]、大豆[12]、花生[13]、芸苔[14]、油菜[15]、黄瓜[16]等均克隆到SAD基因。有报道显示，不同物种中SAD基因家族在不同发育过程中的表达量有极大的不同[17-18]。前人[19-20]研究表明，拟南芥和向日葵突变体缺乏SAD基因时，在拟南芥叶片和向日葵籽粒中均具有较高硬脂酸含量。将马铃薯中的SAD基因转入烟草中，同样发现叶片和种子中的不饱和脂肪酸含量有明显增加[21]。在大豆中已鉴定出GmSAD2的3个等位基因，在发育中的种子中检测到最丰富的GmSADA（Glyma07g32850）和GmSADB（Glyma02g15600）的转录物；然而，GmSADA和GmSADB之间转录本丰度的差异并不显著[22]。前人报道，增加SAD的表达可以在一定程度上提高植物的抗冻性[23-24]；转基因烟草SAD基因过表达，使硬脂酸（18∶0）被催化为油酸（18∶1），进一步产生多不饱和脂肪酸，随着多不饱和脂肪酸含量的增加，转基因烟草及其种子的抗寒性提高[25]。在38℃热胁迫条件下，黄瓜SAD基因表达大部分受到抑制，特别是热处理6h后，观察到SAD基因表达明显受抑制[26]。

目前，SAD基因家族已在拟南芥、水稻、可可等作物中被鉴定。本研究对SbSAD基因家族进行鉴定并进行生物信息学分析，对SbSAD基因家族蛋白特性、进化关系、不同发育阶段表达、染色体定位、保守基序、二级结构和三级结构进行预测及对启动子区顺式作用元件分析，为进一步克隆和鉴定SbSADs基因的生物学功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

2018年10月，在黑龙江八一农垦大学生物技术中心实验室进行SbSAD基因家族的筛选及相关分析。

1.2 SbSADs基因的鉴定

拟南芥SADs基因序列数据来自TAIR数据库（http：//www.arabidopsis.org/），为鉴定候选的高粱SADs基因，使用模式植物拟南芥蛋白质序列分别在 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）中进行Blastp序列比对，选取E＜e-10，氨基酸数大于200的序列。利用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）进一步确定高粱的候选基因。

1.3 SbSADs蛋白的性质及结构域分析

利用在线软件分析SbSADs蛋白性质Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）；利用MEME（http：//meme-suite.org/）分析SbSADs基因的保守基序。

1.4 SbSADs系统进化树与高粱不同发育阶段SbSADs表达量分析

利用MAGE 7.0软件对高粱、玉米、水稻和拟南芥的SADs蛋白构建系统进化树，利用邻接算法且Bootstrap重复设置为1000。利用Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）数据库筛选高粱不同发育阶段SbSADs表达量数据，表达量用每百万测得序列中比对到某一基因每千碱基长度的片段数目（fragments per kilobase per million reads，FPKM）表示。

1.5 SbSADs基因的结构与染色体定位分析

利用 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在线软件分析SbSADs基因结构；利用RCircos软件绘制SbSADs基因在染色体上的位置图谱。

1.6 SbSADs蛋白结构与SbSADs启动子顺式元件分析

利用 NPSA-PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线网站预测SbSADs蛋白二级结构；利用Swiss Model（http：//swissmodel.expasy.org/）在线网站预测SbSADs蛋白三级结构。基因上游2 000bp的启动子序列来自Phytozome数据库，将其提交到Place（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en&pj=640&ac tion=page&page=newplace）网站进行逆境相关的顺式元件分析。

1.7 SbSADs在种子发育时期的表达分析

从NCBI SRA（Sequence Read Archive）数据库获得SbSADs基因在种子不同发育时期的表达量。将高粱BTx623种植在温室（28℃白天/26℃夜晚，10h光周期），选取发育5和10d的种子并迅速在液氮中冷冻，提取种子总RNA，然后进行转录组测序。转录组数据在NCBI中的登录号为SRP008505和SRP008469。

2 结果与分析

2.1 SbSAD基因家族蛋白特性分析

以拟南芥蛋白序列作为比对序列进行同源序列比对，共鉴定出11个SbSADs基因。表1显示，SbSADs的编码区为 1 134～1 290bp；SbSADs蛋白的氨基酸数为377～449；在SbSAD基因家族中，分子量最大为48.0kDa，最小为39.8kDa；等电点为5.26～8.76。

表1 高粱SbSADs蛋白特性分析Table 1 Analysis of protein characterization of SbSADs in sorghum

2.2 SbSAD基因家族蛋白系统进化树及高粱不同发育阶段SbSADs表达量分析

为明确SbSAD基因家族蛋白进化关系，选取拟南芥、水稻、玉米和高粱SAD蛋白构建系统进化树。由图1可知，根据植物的单子叶和双子叶亲缘关系对SbSADs进行分类，11个SbSADs被分为3个亚族，其中亚族I含有水稻、高粱和玉米3个物种SADs；亚族II仅含有拟南芥SADs；亚族III含有水稻、高粱和玉米3个物种SADs；由此表明，SbSADs与单子叶植物玉米和水稻存在着密切的同源关系。

图1 水稻、玉米、拟南芥和高粱SADs蛋白系统进化关系Fig.1 Phylogenetic relationships of SAD proteins from rice, maize, Arabidopsis and sorghum

另外，利用高粱不同发育阶段SbSADs的表达情况来进一步表征SbSADs系统进化关系。图2为SbSAD6和SbSAD9在高粱的不同发育阶段的表达情况；其中SbSAD9在开花期和幼嫩期的表达量较高，SbSAD6在成熟期比在开花期表达量高。结合系统进化树与不同组织部位发育阶段SbSADs的表达情况进行分析，结果表明，亚族I基因在不同发育阶段均有表达（图2）。

图2 SbSAD基因家族在高粱不同发育阶段不同组织中的表达量Fig.2 The expression profile of SbSADs gene family at different developmental stages and tissues in sorghum

2.3 SbSADs基因结构分析

利用 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在线软件分析SbSAD基因家族内含子和外显子的数目，结果如图3所示，在SbSAD基因家族中，SbSAD8的外显子数最多，含有6个外显子；SbSAD2、SbSAD4和SbSAD11均仅含有1个外显子；其他基因含有2～3个外显子。同时发现，SbSAD6和SbSAD9的基因结构高度相似，表明SbSAD基因家族在每个亚族相对保守。

图3 高粱SbSAD基因家族结构分析Fig.3 Genetic structure analysis of SbSAD gene family in sorghum

2.4 SbSADs蛋白保守基序分析

利用MEME（http：//meme-suite.org/）在线分析软件预测SbSADs蛋白的保守基序，如图4所示，共鉴定到10个保守基序，其中SbSAD5、SbSAD6、SbSAD7和SbSAD9含有保守基序最多，含有10个保守基序；SbSAD8含有保守基序最少，仅含有3个保守基序；其余SbSADs含有8～9个保守基序。由此表明，SbSADs中保守基序相似度较高，同源关系较近，功能相对保守。

图4 SbSADs蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of SbSADs protein

2.5 SbSAD基因家族染色体定位分析

SbSAD基因家族染色体定位如图5所示，SbSAD基因家族不均匀地分布在高粱的7条染色体上，SbSAD基因家族在高粱1号染色体上定位最多，含有SbSAD1、SbSAD2和SbSAD3基因；SbSAD4、SbSAD9、SbSAD10和SbSAD11分别定位在高粱2、6、7和10号染色体上；SbSAD5和SbSAD6定位在高粱3号染色体上；SbSAD7和SbSAD8定位在高粱4号染色体上；其中SbSAD5和SbSAD6基因及SbSAD7和SbSAD8基因在高粱染色体上位置相近。

2.6 SbSADs蛋白的二级结构和三级结构分析

对SbSADs蛋白二级结构氨基酸数目进行预测分析，氨基酸α-螺旋比例介于40.58%～59.27%，无规则卷曲比例介于22.68%～38.73%，延长链的比例在7.56%～14.32%，β-折叠的比例为6.37%～12.03%。由此可知，SbSADs蛋白均以α-螺旋和无规则卷曲为主要结构（表2，图6A）。对SbSADs蛋白三级结构预测分析显示，除SbSAD8外，其余SbSADs的蛋白三级结构高度相似（图6B）。

图5 SbSADs基因的染色体分布Fig.5 Chromosomal location of SbSADs

表2 SbSADs蛋白二级结构的氨基酸数目和比例Table 2 Amino acid number and percentage of secondary structure of SbSADs protein

2.7 SbSADs启动子与逆境相关顺式作用元件分析

图6 SbSADs蛋白二级结构(A)和三级结构(B)的预测结果Fig.6 Prediction results of secondary structure (A) and tertiary structure (B) of SbSADs protein

温度胁迫影响植物细胞膜的流动性，当植物遭受低温时，细胞膜流动性升高，抗寒能力增强；当植物遭受高温时，细胞膜的流动性降低。在SbSADs启动子区查找有关低温和高温等非生物胁迫相关的顺式作用元件并进行分析。在SbSAD基因家族中，当植物遭受低温胁迫时，SbSADs基因的顺式作用元件数量均较多；与其他基因相比，SbSAD1、SbSAD2、SbSAD5和SbSAD9顺式作用元件数量较多；而当植物遭受高温胁迫时，SbSADs基因的顺式作用元件数量均较少；与其他基因相比，SbSAD3和SbSAD10顺式作用元件数较多（图 7）。

图7 SbSADs基因启动子逆境相关顺式作用元件数量分布Fig.7 Distribution of cis-elements in SbSADs gene promoters

2.8 SbSADs在高粱种子发育时期表达分析

高粱籽粒中有较高含量的脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量占脂肪酸含量的82%左右。从NCBI数据库中获得高粱种子发育时期SbSADs表达量数据，探究高粱种子发育时期SbSADs表达情况。如图8所示，从种子发育时期SbSADs的表达量数据中共发现4个SbSADs基因表达，其中SbSAD1和SbSAD5在种子发育5d时表达量较高；在种子发育10d时仅有SbSAD5有较高的表达量，其余基因表达量均较低。综上表明，SbSAD5在种子发育时期有较高的表达量。

图8 SbSADs在种子不同发育时期的表达Fig.8 Expression of SbSADs gene at different development days of seeds

3 讨论

目前，高等植物中SAD是唯一确定的可溶性脂肪酸脱氢酶，高粱SAD将硬脂酸脱氢插入1个双键，生成油酸，油酸是形成多不饱和脂肪酸的前体，决定多不饱和脂肪酸的含量[16，27]。SAD基因家族已在玉米[28]、棉花[29]等多种作物中报道。至今SbSAD基因家族仍未有报道，因此本研究对SbSAD基因家族进行鉴定及生物信息学分析，为进一步研究SbSADs功能提供理论基础。

根据系统进化树分析，SbSAD基因家族被分为3个亚族，亚族I仅含SbSAD6和SbSAD9基因，同时发现SbSAD6和SbSAD9在高粱不同发育阶段有表达。前人研究发现，在玉米中SAD基因家族被分为2个亚族，其中1个亚族在玉米不同发育阶段表达量较高[28]；在棉花SAD基因家族中发现其中1个亚族在不同阶段的表达量也均较高，并且其中1个亚族基因在棉花中扮演重要角色[29]。本研究与前人的研究结果一致，表明SbSAD6和SbSAD9在高粱不同发育阶段以及合成油酸过程中扮演重要角色。

SAD基因家族参与细胞膜中不饱和脂肪酸的合成，同时影响细胞膜流动性及其耐受能力。前人研究表明，缺失SAD基因的拟南芥突变体在叶片中含有较高的硬脂酸[19]；在拟南芥中，AtSSI2在调节拟南芥叶片中油酸（18∶1）含量方面扮演重要角色[11]；在玉米中，当ZmSAD基因表达下调时，会增加玉米叶片中硬脂酸的含量[30]；在拟南芥中SAD基因家族已被鉴定并进行活性分析，发现在SAD基因家族中，仅有1个AtSAD基因活性较高[11]。本研究通过分析SbSAD基因家族在高粱不同组织部位发育阶段的表达情况，发现SbSAD6和SbSAD9在高粱不同发育阶段均有表达，由此可知SbSAD6和SbSAD9基因在高粱组织发育阶段扮演重要角色。

4 结论

本研究共鉴定到11个SbSADs基因。对SbSAD基因家族进行生物信息学分析，结果发现SbSAD6和SbSAD9在高粱发育过程中发挥重要作用。