稻瘟病菌杂交后代致病性遗传分析

张晓玉 张亚玲 靳学慧 闫天雨 赵 泽

（黑龙江八一农垦大学/黑龙江省植物抗性研究中心，163319，黑龙江大庆）

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，无性态为Pyricularia oryzae）引起的严重侵染性病害，是全世界水稻产区的重要病害之一[1]。20世纪90年代以来，稻瘟病在我国各稻区大面积持续流行，发病面积年均超过4 000万hm2，造成的损失高达10亿kg[2]。目前，防治稻瘟病最普遍、最有效的措施就是种植抗病品种，因此，深入研究水稻与稻瘟病之间相互作用关系十分重要。

自1971年Hebert[3]首次报道马唐瘟菌于培养基上对峙培养，成功诱发形成有性世代，1979年Kato等[4]首次证明，在实验室条件下，稻瘟病菌株可发生有性生殖，从而使有关稻瘟病菌有性态的研究工作大量开展。虽然稻瘟病菌是否在自然界中发生有性生殖没有准确结论[5]，但研究稻瘟病菌有性生殖后代与水稻品种的相互作用关系是定位和克隆无毒基因的重要手段。迄今为止，稻瘟病菌中已经鉴定出40多个无毒基因，但仅 有PWL1[6]、PWL2[7]、PWL3[6]、PWL4[6]、Avr1-CO39[8]、Avr-Pita[9]、ACE1[10]、Avr-Pia[11]、Avr-Pii[12]、Avr-Pik/km/kp[12]、AvrPiz-t[13]、Avr-Pi9[14]、Avr-Pib[15]、Avr-Pita1[16]等14个无毒基因被克隆。近年来，也有不少研究学者对稻瘟病菌杂交组合产生有性后代进行无毒性/毒性及亲本菌株无毒基因组成情况分析。刘俊峰等[17]利用育性较好的稻瘟病菌进行交配，分析其杂交后代对水稻品种梅雨明致病性的分离情况，研究表明亲本菌株对水稻品种梅雨明的无毒性是由1个基因控制；Ma等[18]利用121个SSR标记在稻瘟病菌株CHL346和CHL42的杂交后代中定位了无毒基因APi15；王艳丽等[19]利用无毒性/毒性与SSR、SCAR和RAPD等分子标记结合构建稻瘟病菌的遗传图谱，将无 毒 基 因Avr2-K59、AvrC105TTP1、AvrZh156、AvrXuan1641、AvrXuan6392、Avr103TTP定 位 在第1、第4和第7染色体上。

目前，仍有大量无毒基因未被准确定位及克隆。本研究利用国际稻瘟病菌标准交配型菌株KA3及黑龙江省育性较好的稻瘟病菌株HLJ6122杂交产生的后代群体对已知抗性基因品种致病性分离结果，分析亲本菌株无毒基因的组成情况，为相应无毒基因的遗传图谱构建及克隆提供分析材料。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为国际稻瘟病菌标准交配型菌株KA3（交配型MAT1-1）和黑龙江省稻瘟病菌株HLJ6122（交配型MAT1-2）及其64个杂交后代单孢菌株。KA3菌株由福建农林大学植物保护学院王宗华教授和王宝华副教授提供，HLJ6122菌株分离自黑龙江省水稻种植区的发病植株。

1.2 供试水稻品种

已知抗性的IRBL系列水稻品种：IRBLa-A（Pi-a）、IRBLi-F5（Pi-i）、IRBLk-Ka（Pi-k）、IRBLkp-K60（Pi-kp）、IRBLz-Fu（Pi-z）、IRBLzt-T（Pi-zt）、IRBLta-K1（Pi-ta）、IRBLb-B（Pi-b）、IRBL7-W（Pi-7t）、IRBL12-M（Pi-12t）、IRBL19-M（Pi-19t）、IRBLkm-Ts（Pi-km）、IRBL20-IR24（Pi-20）、IRBLta2-Pi（Pi-ta2），以丽江新团黑谷为感病对照。试验材料均由黑龙江省植物抗性研究中心提供。

1.3 稻瘟病菌的交配及子囊孢子的分离

试验于2019年进行。稻瘟病菌交配及子囊孢子分离的具体方法参见王宝华[20]的方法。将2个亲本菌株HLJ6122和KA3在燕麦培养基上对峙培养。将菌株先在28℃恒温培养，待菌落边缘相遇，转移到20℃条件下光照培养15～20d，直至菌株间产生明显而成熟的子囊壳。

在子囊壳完全成熟后，用接种针挑单个子囊壳置于装有灭菌水的载玻片中；盖上盖玻片，轻轻挤压以释放子囊孢子；移走盖玻片，用适量无菌水将子囊孢子洗入已制备好的水琼脂培养基平板上，用灭菌的三角玻璃棒涂布于平板表面上。于培养箱中28℃恒温培养，24h后检查子囊孢子的萌发情况，将萌发的单个子囊孢子挑取到PDA培养基上，继续于28℃培养。

1.4 育苗与接种

采用室内水培法进行水稻育苗。挑选饱满的种子，用1.25‰的多菌灵溶液浸种24h后，于28℃恒温培养箱内催芽，播种于固定在塑料水培盒内的定植篮中，每个定植篮播种10粒，待苗长至3叶1心期后，采用喷雾法接种，即将含有0.01%的吐温20的孢子悬浮液均匀喷洒到水稻叶片上，接菌后在28℃黑暗培养24h，继续保湿培养5d[21-22]。接种后7～10d，按照稻瘟病病情调查标准分级记载发病情况。根据分级标准，0～3级为抗病（A），4～9级为感病（V）。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌HLJ6122与KA3毒性差异分析

将2个亲本菌株HLJ6122和KA3接种在14个水稻品种上，作为对照的丽江新团黑谷在所有的接种试验中均为感病，表明接种条件适宜。亲本菌株HLJ6122除对IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共4个水稻品种无毒外，对其他供试水稻品种均有毒，亲本菌株KA3只对IRBLkp-K60水稻品种有毒，对其他水稻品种均无毒，结果见表1。亲本菌株HLJ6122和KA3只在IRBLk-Ka、IRBLkp-K60、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共5个水稻品种上毒性类型一致，其中，亲本菌株HLJ6122和KA3对 IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共4个水稻品种表现为无毒性，对IRBLkp-K60品种均表现为毒性。由此可见，稻瘟病菌HLJ6122和KA3之间存在较大的毒性差异，对二者交配产生的有性后代进行致病性遗传分析有着重要意义。

2.2 亲本菌株致病性的遗传分析

2个亲本菌株HLJ6122和KA3杂交产生的64个子囊孢子对各供试水稻品种的毒性分离比例情况见表1。2个亲本菌株对不同的供试水稻品种毒性不同，表明供试菌株作用在不同水稻品种上具有不同的遗传背景，在14个供试水稻品种中，亲本菌株 HLJ6122对 IRBLa-A、IRBLi-F5、IRBLkp-K60、IRBLzt-T、IRBLta-K1、IRBL7-W、IRBL12-M、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24、IRBLta2-Pi共 10个水稻品种产生毒性，而KA3对其均无毒性，其中杂交后代菌株对IRBLi-F5、IRBLta-K1、IRBL12-M、IRBLta2-Pi共4个水稻品种的无毒性/毒性分离比分别为 35∶29、37∶27、30∶33、25∶39，卡平方测验χ2＜3.84，差异不显著，结果符合1∶1的期望值，据此推断亲本菌株KA3对以上水稻品种的非致病性均受单个基因控制；对IRBLa-A、IRBLzt-T、IRBL7-W、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24共5个水稻品种杂交后代产生的无毒性/毒性分离比分别为41∶23、38∶21、21∶41、12∶51、21∶43，卡平方测验均χ2＜3.84，差异不显著，结果符合1∶3或3∶1的期望值，表明亲本菌株KA3对这些水稻品种的非致病性受2个基因控制。

表1 KA3与HLJ6122及其64个杂交后代菌株在单基因系水稻品种上的毒性差异Table 1 Segregation of virulence between KA3 and HLJ6122 and their 64 progeny isolates on single-gene rice varieties

亲本菌株HLJ6122和KA3对IRBLkp-K60品种均表现为有毒，后代群体中出现9个对其无毒的个体，55个对其有毒的个体，卡平方测验χ2＜3.84，差异不显著，结果符合1∶3的期望值，推测出现这一现象的原因是由于无毒基因在亲本菌株中的表达受到抑制；2个亲本菌株对IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M水稻品种均表现为无毒，其后代菌株却出现有毒个体，对水稻品种的无毒性/毒性比分别为 53∶10、55∶9、57∶7、52∶12，卡平方测验χ2＜3.84，差异不显著，结果也符合1∶3的期望值，因此对稻瘟病菌无毒基因遗传分析还需进行深入研究。

2.3 稻瘟病菌杂交后代对供试水稻品种的无毒性/毒性分析

将2个亲本菌株HLJ6122和KA3杂交产生的64个子囊孢子后代接种在14个水稻品种上，出现了明显的毒性分离，共出现53种毒性类型，其中毒性类型A1由4个菌株组成，与亲本菌株HLJ6122毒性类型一致；毒性类型A2～A6分别由4、3、2、2、2个菌株组成（表2）。其他47个毒性类型均由单个菌株组成，没有与亲本菌株KA3相同的毒性类型。

表2 稻瘟病菌HLJ6122与KA3杂交后代在14个水稻品种的毒性分离Table 2 Virulence separation of sexual progeny from the cross Magnaporthe oryzae HLJ6122 and KA3 on 14 rice varieties

2个亲本菌株对IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共4个水稻品种毒性类型一致，均表现为无毒。在这4个水稻品种中，其后代菌株共出现12种毒性类型（表3），其中毒性类型B1由43个菌株组成，与2个亲本菌株毒性一致，均表现为无毒；毒性类型B3由3个菌株组成，对以上4个品种均表现为有毒；毒性类型B2、B4、B5分别由6、3、2个菌株组成；剩余7个毒性类型均有1个菌株构成。

表3 稻瘟病菌HLJ6122与KA3杂交后代在4个水稻品种的毒性分离Table 3 Virulence separation of sexual progeny from the cross Magnaporthe oryzae HLJ6122 and KA3 on 4 rice varieties

对于IRBLa-A、IRBLi-F5、IRBLzt-T、IRBLta-K1、IRBL7-W、IRBL12-M、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24、IRBLta2-Pi水稻品种，亲本菌株HLJ6122均表现为有毒，KA3均表现为无毒，其杂交后代出现44种毒性类型（表4），其中有12个菌株与亲本菌株HLJ6122毒性一致，均表现为有毒，组成毒性类型C1；毒性类型C2、C3、C4、C5、C6、C7分别包含5、2、2、2、2、2个菌株；剩余37个毒性类型均仅有1个菌株，没有与亲本菌株KA3毒性一致的菌株。2个亲本菌株对水稻品种IRBLkp-K60均有毒，其杂交后代中有9个菌株对该水稻品种没有毒性，其他55个菌株均有毒性。

表4 稻瘟病菌HLJ6122与KA3杂交后代在9个水稻品种的毒性分离Table 4 Virulence separation of sexual progeny from the cross Magnaporthe oryzae HLJ6122 and KA3 on 9 rice varieties

3 讨论

水稻与稻瘟病菌之间的相互作用符合经典“基因对基因”假说，在水稻中每个显性的抗性基因，在稻瘟病菌中就会有与之相对应的显性无毒基因[23]，水稻只有存在相应的抗病基因，而稻瘟病菌中又存在相对应的无毒基因，才能表现出抗病。早在20世纪20年代，日本学者首次报道了稻瘟病菌对水稻品种的致病性存在差异，利用其杂交后代的遗传学分析证明水稻与稻瘟病互作关系符合孟德尔遗传规律[24]。

本试验将HLJ6122与KA3菌株的杂交后代对已知抗性基因的14个IRBL基因系列水稻品种进行接种试验。结果表明，稻瘟病菌对多数水稻品种的无毒性/毒性分离符合孟德尔遗传规律，表现为1∶1、1∶3、3∶1、15∶1 分离比例，同时表明控制病原菌对不同水稻品种无毒性/毒性的基因数量不同。菌株KA3分别对水稻品种IRBLi-F5、IRBLta-K1、IRBL12-M、IRBLta2-Pi持有1个基因，对品种IRBLa-A、IRBLzt-T、IRBL7-W、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24持有2个基因。陆凡等[25]、李进斌等[26]、王艳丽等[27]研究也表明亲本菌株的有性后代对不同水稻品种无毒性/毒性比例是由基因数量调控的。

然而，对病菌的非致病基因是否为显性表达，仍未有明确定论[28]。大多数研究学者认为病菌的非致病基因是显性表达，而有研究表明稻瘟病菌的无毒基因是否为显性表达还有待研究[25，29]。Lau等[30]对亲本菌株杂交产生的有性后代进行遗传分析，表明亲本菌株中存在无毒基因的抑制子基因。病菌的无毒基因在表达的过程中存在抑制子基因，亲本菌株对IRBLkp-K60品种均表现为有毒，后代菌株中却出现无毒个体，推测可能因为亲本菌株之一存在无毒基因的抑制子基因，导致无毒基因失去表达功能，或者由于基因发生突变，使后代个体表现无毒[31-32]。本研究结果也支持这一观点，2个亲本菌株 HLJ6122和 KA3对 IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBL19-M、IRBLb-B共4个水稻品种均表现为无毒，其后代菌株却出现有毒个体，有毒个体分别为10、9、7、12个。也有相似的研究结果，如王宝华[20]、王艳丽等[27]对杂交后代群体进行遗传分析时，2个亲本菌株对品种表现无毒，而后代菌株出现毒性分离，分析可能原因是2个亲本菌株均含有1个非等位的无毒基因，在有性过程中，染色体发生变异，导致后代的无毒基因失去表达功能，从而表现为有毒性。

利用已知抗性基因的水稻品种对稻瘟病菌无毒基因进行遗传分析是推定、分析和比较无毒基因的有效手段，是无毒基因物理图谱构建及克隆的前提条件。但稻瘟病菌无毒基因与水稻的抗性基因相互作用机制复杂，因此探究稻瘟病菌对水稻品种无毒性/毒性遗传规律还需进一步深入研究。

4 结论

采用14个单基因系水稻品种对稻瘟病菌亲本菌株HLJ6122和KA3进行遗传分析，结果表明共出现53种毒性类型，无毒性/毒性比分别表现为1∶1、1∶3、3∶1、15∶1。结果证明稻瘟病菌杂交后代菌株对水稻品种产生毒性类型较为复杂，并符合孟德尔遗传规律。