纤维素酶酶解啤酒糟的工艺研究

曲亮璠，郑雅元，曹琳琳，朱敬华，王祥河，4，

（1.天津市工业微生物研究所有限公司，天津 300462；2.天津量信检验认证技术有限公司，天津 300462；3.天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，天津 300462；4.天津市工业微生物企业重点实验室，天津 300462）

中国是世界上啤酒生产量最大的国家。啤酒糟是麦芽、啤酒花等酿酒原料经过糖化、糊化等一系列工艺后，通过压滤所残留的固体物质[1-2]，资源丰富且价格低廉。据文献报道，啤酒糟中蛋白质含量高达20%～30%[3]。由于啤酒糟结构特殊，啤酒糟蛋白被周围纤维素紧紧包埋住，二者紧密结合，采用碱提取法[4]、醇提取法[5]、醇-碱提取法[6]、酶提取法[7]直接对其进行处理，粗蛋白的提取率和纯度都较低。针对啤酒糟的结构特征，首先将纤维素分解成糖类，再对其中含量较高的蛋白质以及多肽等物质进行提取、分离、纯化，可实现啤酒糟的高效利用。

本文采用纤维素酶处理啤酒糟，水解啤酒糟中的纤维素，通过正交试验确立了酶解的最佳工艺条件，为废弃啤酒糟中蛋白质的开发与功能性多肽的制备奠定理论基础，以期为啤酒加工副产物—啤酒糟的广泛应用提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒糟来源：雪花啤酒厂。

盐酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；亚甲蓝：天津大茂化学试剂厂；酒石酸钾钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠：天津市北方天医化学试剂厂；乙酸锌、冰乙酸、亚铁氰化钾：天津津科精细化工研究所；上述试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AE200 分析天平、Seven Multi pH 计：梅特勒-托利多国际贸易有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：上海力辰仪器科技有限公司；GZX-9146 MBE数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；FW80 微型高速万能试样粉碎机：河北巨轮贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 啤酒糟预处理

将新鲜的啤酒糟原料置于70 ℃烘箱内鼓风烘干，将干燥好的样品用微型高速万能试样粉碎机粉碎，再将其过80 目筛储存备用。

1.3.2 还原糖含量测定方法

参照GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》直接滴定法测定啤酒糟酶解液中还原糖的含量[8]。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 料液比对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

准确称取啤酒糟干粉5.0 g 于6 个250 mL 的三角瓶中，纤维素酶添加量为2.0%，反应初始pH6.0，设定料液比分别为 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），温度50 ℃，在磁力搅拌下酶解4 h，测定啤酒糟酶解液中还原糖的含量。

1.3.3.2 酶解时间对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

准确称取啤酒糟干粉5.0 g 于6 个250 mL 的三角瓶中，纤维素酶添加量为2.0%，反应初始pH6.0，料液比 1∶25（g/mL），温度 50 ℃，在磁力搅拌下分别酶解2、3、4、5、6、7 h，测定啤酒糟酶解液中还原糖的含量。

1.3.3.3 初始pH 值对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

准确称取啤酒糟干粉5.0 g 于5 个250 mL 的三角瓶中，纤维素酶添加量为2.0%，设定反应初始pH 值分别为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，料液比 1∶25（g/mL），温度50 ℃，在磁力搅拌下酶解4 h，测定啤酒糟酶解液中还原糖的含量。

1.3.3.4 酶解温度对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

准确称取啤酒糟干粉5.0 g 于5 个250 mL 的三角瓶中，纤维素酶添加量为2.0%，反应初始pH6.0，料液比 1∶25（g/mL），将反应温度分别设定为 45、50、55、60、65 ℃，在磁力搅拌下酶解4 h，测定啤酒糟酶解液中还原糖的含量。

1.3.3.5 纤维素酶添加量对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

准确称取啤酒糟干粉5.0 g 于7 个250 mL 的三角瓶中，设定纤维素酶添加量分别为0.25 %、0.5 %、1.0 %、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，反应初始pH6.0，料液比 1∶25（g/mL），温度 50 ℃，在磁力搅拌下酶解 4 h，测定啤酒糟酶解液中还原糖的含量。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取pH 值、纤维素酶添加量、酶解时间3 个因素，以啤酒糟酶解液中还原糖的含量为指标进行三因素三水平的正交试验，正交因素与水平见表1。

表1 正交因素与水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

料液比对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响如图1 所示。

料液比从 1∶15（g/mL）增加到 1∶40（g/mL），酶解液中还原糖的含量为别为 174.22、175.76、174.50、180.10、174.9、182.01 mg。不同料液比条件对酶解过程中产生还原糖的总量不存在显著性影响。综合考虑经济因素以及还原糖滴定试验的便捷性因素，将纤维素酶酶解啤酒糟的料液比定为 1∶25（g/mL）。

2.1.2 酶解时间对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

酶解时间对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响如图2 所示。

图1 料液比对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响Fig.1 Effect of feed liquid-ratio on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

图2 酶解时间对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

由图2 可知，在反应初始时期，还原糖含量随酶与底物作用时间的延长而增加，且增长速度较快；酶解4 h 以后，还原糖浓度的曲线逐渐趋于平缓，变化不再明显。当纤维素酶与啤酒糟作用时间从2 h 延长至7 h，酶解液中还原糖的含量分别为 2.33、2.63、2.82、2.87、2.90、2.90 mg/mL。这可能是由于在酶解反应进行的初期，啤酒糟纤维素浓度较高，纤维素酶与底物的结合更为充分，随着反应的持续进行，受到产物抑制、纤维素酶活相对下降等因素的影响，底物浓度也逐渐趋于稳定，溶液中还原糖的含量不再有明显的变化[9]。因此，将纤维素酶酶解啤酒糟的酶解时间定为4 h。

2.1.3 反应初始pH 值对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

反应初始pH 值对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响如图3 所示。

图3 反应初始pH 值对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响Fig.3 Effect of initial pH value on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

还原糖含量在pH 值4.0～8.0 范围内呈现先增大后减小的趋势。当酶解环境的 pH 值分别为 4、5、6、7、8时，酶解液中还原糖的含量为别为2.93、2.98、2.79、2.65、2.65 mg/mL。不同pH 值环境下，酶蛋白质分子的构象发生变化，其侧链上的氨基酸基团处于不同的解离状态，表现出不同的酶活性[10]。在啤酒糟酶解过程中，要控制反应的pH 值，使酶活性中心表现出最大催化活力，提高反应效率，缩短反应时间。因此，将纤维素酶酶解啤酒糟酶解反应的初始pH 值定为5。

2.1.4 酶解温度对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

酶解温度对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响如图4 所示。

在45 ℃～65 ℃范围内，还原糖含量随着反应体系温度的升高呈现先上升后下降的趋势，当温度为45、50、55、60、65 ℃时，还原糖含量分别为 1.63、2.92、2.72、2.25、2.05 mg/mL。酶在起催化作用时，需要一个特殊的靶向位点才能与目标底物相结合。温度将影响蛋白酶分子的空间构象以及这些位点的活性高低。通常在较低温度，酶活力较小，催化速率较低。在低温下，随反应温度的逐渐上升，酶活力也逐渐升高。但反应温度过高会导致纤维素酶的稳定性不佳，影响酶和底物的结合，最终使酶解液中还原糖浓度下降[11]。因此，将纤维素酶酶解啤酒糟的酶解温度定为50 ℃。

2.1.5 纤维素酶添加量对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响

纤维素酶添加量对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响如图5 所示。

图5 纤维素酶添加量对啤酒糟酶解液中还原糖含量的影响Fig.5 Effect of cellulase addition on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

当纤维素酶的添加量为0.25 %、0.50 %、0.75 %、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时，酶解液中的还原糖含量分别为 1.34、1.59、2.19、2.62、2.98、3.19、3.17 mg/mL。还原糖含量随着纤维素酶添加量的增加而增加，当添加量超过2.0%时，上升趋势渐缓，最终达到平衡。酶添加量较少时，纤维素酶为决定性因素；酶添加量较多时，底物含量为决定性因素，此时持续增加纤维素酶不能提高还原糖含量[12-14]。综合考虑经济因素以及试验结果，将纤维素酶的最适添加量定为2.0%。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，选取酶添加量（1.5 %、2.0 %、2.5%）、pH 值（4、5、6）、酶解时间（3、4、5 h）3 个条件，采用三因素三水平的正交试验对纤维素酶酶解啤酒糟的试验条件进行优化。正交试验结果如表2 所示，正交试验方差分析结果如表3 所示。

通过正交试验表中的极差值可以看出各因素对纤维素酶酶解作用影响的大小顺序为B＞A＞C，即酶添加量＞pH 值＞反应时间。以酶解液中还原糖含量为主要考核指标进行方差分析与极差分析，得到工艺的最佳组合为A3B3C2，因此纤维素酶酶解啤酒糟的最佳条件为：pH6.0，加酶量2.5%，酶解时间4 h。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment

3 结论

在纤维素酶处理啤酒糟的试验中，酶解时间、反应初始pH 值、酶解温度和酶添加量对酶解液中还原糖的含量有一定影响，不同料液比对酶解液中还原糖含量的影响不显著。选取pH 值、酶添加量、酶解时间三个条件，以还原糖含量为指标，通过三因素三水平的正交试验优化纤维素酶酶解啤酒糟工艺，试验结果表明，最佳工艺条件为初始pH6.0，酶添加量2.5%，酶解时间4 h。在此条件下，酶解液中的还原糖含量为3.65 mg/mL。