幽门螺杆菌Tipα蛋白经激活NF-kB对巨噬细胞分泌细胞因子诱导机制分析

李杰，熊礼杭，严洁

（1永州职业技术学院，湖南 永州 425100；2.永州职业技术学院附属医院，湖南 永州 425100）

0 引言

有研究发现，重组Tipα蛋白（rTipα）经激活NF-kB会诱导THP-1细胞产生分泌IL-1β以及IL-6细胞因子。而IL-1β以及IL-6细胞因子在THP-1细胞中的生产与分泌均与激活酶半胱天冬酶-1（Caspase-1）活化相关，Caspase-1活化过程受胞浆内多蛋白复合体NLRP3炎性小体的调控[1]。本研究以探讨幽门螺杆菌Tipα蛋白经激活NF-kB对巨噬细胞分泌细胞因子诱导机制。探究幽门螺杆菌持续性感染以及对导致发生胃黏膜炎症反应机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

菌株选择E.coli BL21菌株，载体选择pET-30a（+），THP-1细胞、H.pylori-26695标准株为本研究保存样本。选用细菌基因组提取试剂盒及配套试剂，DNA快速纯化试剂盒及配套试剂，BCA蛋白浓度检测试剂盒及配套试剂，高纯质粒小提取试剂盒及配套试剂，康为世纪公司生产ECL化学发光显色试剂盒及配套试剂，厦门市鲎试剂实验厂生产去内毒素试剂盒，欣博盛生物科技有限公司生产人TNF-α、人IL-1β以及人IL-6的ELISA检测试剂盒及配套试剂。

1.2 主要试剂

Tipα蛋白目的基因引物；康为公司生产Supper DNA Marker，Dye公司生产2×Es Taq MasterMix；Thermo公司生产Barn-HI限制性内切酶、Xho-I限制性内切酶以及T4连接酶；鼠抗His、兔抗β-actin、兔抗Caspase-1、羊抗鼠IgG（+）HRP、羊抗兔IgG（+）HRP以及兔抗NLRP3 p20亚单位抗体；10%浓度胎牛血清；碧云天生物公司生产PDTC；Fermentas公司生产蛋白预染Mark-er、RI-PA缓冲液、LPS、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、多黏菌素B、两性霉素B、万古霉素以及三甲氧苄氨嘧啶（TMP）[2]。

1.3 对Tipα重组蛋白的鉴定及纯化处理

将Tipα重组蛋白置于1 mmol/L浓度的IPTG，于30℃温度下进行诱导表达4 h，经Western Blot对表达结果进行鉴定，通过His纯化树脂对重组蛋白进行去内毒素纯化处理。

1.4 对THP-1的细胞培养及建立模型

应用胎牛血清制作RPMI-1640培养基，对THP-1细胞进行培养，并且通过PMA诱导分化巨噬细胞。分别用0-200 μg/mL的Tipα重组纯化蛋白激活细胞，设置200 ng/mL的LPS作为阳性结果对照组、设置PBS作为阴性结果对照组，对每组均设置3个复孔，置于37℃的恒温培养箱当中分别培养0-24 h，取各孔的上清液进行试验

1.5 ELISA法与Western Blot检测

ELISA法检测TNF-α、IL-1β以及IL-6等 炎症细胞因子的表达水平，对预处理前后的Tipα诱导细胞的促炎细胞因子水平进行检测对比，通过Western Blot法对NLRP3、Caspase-1分子表达水平进行检测。ELISA法与Western Blot检测依据各检测试剂盒操作说明书进行规范操作[3]。

1.6 统计学处理

数据通过SPSS 16.0进行分析。

2 结果

不同浓度Tipα蛋白诱导巨噬细胞在24 h时的TNF-α、IL-1β以及IL-6表达水平不同。随Tipα蛋白浓度提高，TNF-α、IL-1β以及IL-6表达水平也相应提高，当Tipα含量增加至200μg/ mL时，尚未有明显细胞毒性出现，见表1。

3 讨论

表1 不同浓度Tipα蛋白诱导TNF-α、IL-1β以及IL-6表达水平

本研究通过分子克隆技术，以Hp基因组DNA作模板，对 Tipα基因的原核表达载体pET30a-Tipα进行构建，再经PCR、位点酶切以及基因测序后验证插入Tipα基因的序列与Genebank的基因序列相符，确保纯化所得到蛋白是Tipα蛋白[4-6]。而在蛋白的提纯及纯化过程当中，菌内毒素污染是常见的问题，尤其对于巨噬细胞而言，即使是极低剂量的内毒素都可即可促使其分泌出高水平炎症因子，导致蛋白的自身作用被掩饰。在本研究中，对纯化后蛋白进行去内毒素处理。对细胞因子的分泌水平进行检测时，也采通过多黏菌素B作为对照。研究提示多黏菌素B对LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α产生显著抑制作用（P＜0.05）。对于Tipα诱导所产生TNF-α则无明显的影响（P＞0.05）。为验证Tipα蛋白对诱导巨噬细胞分泌炎症因子能力，本研究以不同剂量的经去内毒素处理Tipα蛋白刺激THP-1源性巨噬细胞，通过ELISA法检测，在30-200μg/mL浓度范围内，Tipα蛋白浓度提高，TNF-α、IL-1β以及IL-6表达水平也相应提高，当Tipα含量增加至200μg/mL时，尚未有明显细胞毒性出现。研究提示，Tipα蛋白可在一定程度上起到诱导THP-1细胞产生并分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6。

综上所述，研究初步表明Tipα蛋白经激活NF-κB诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎症因子。