芳香新塔花对动脉粥样硬化模型小鼠Toll 样受体-4/核因子-κB 信号通路的影响

张华，马学宽，王思静，张选明，倪昀，王丽，安冬青

芳香新塔花（新塔花）为唇形科半灌木状植物新塔花的地上部分，又名唇香草，在我国主要分布在新疆、内蒙古等地区。新塔花全草中的化学成分主要为挥发油、非挥发油两部分，新塔花挥发油为透明淡黄色油状液体，约占全草的2%，国外有学者采用气质联用法和气相色谱法进行化学分析，发现了其中27 种成分，主要包括胡薄荷酮（44.5%）、萜品醇（14.5%）等，非挥发油主要以总黄酮类为主[1-2]。近些年，新塔花在国内外受到广泛关注，大量研究表明，新塔花成分具有抗炎止痛、舒张血管、降血压、抗氧化、改善心肌缺血等作用[3-9]，主要用于治疗失眠、高血压、冠心病等疾病，但其作用机制尚不明确[5,10]。目前关于新塔花抗动脉粥样硬化（AS）的研究国内外文献报道较少，本研究运用苏木精-伊红（HE）染色法、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法（Western Blot）探讨了新塔花防治AS 的炎症机制。

1 材料与方法

实验动物：选取40 只8 周龄雄性载脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠，10 只同品系C57 普通小鼠，平均体重（18.0±2.0）g，均购于北京维通利华公司；饲养于新疆医科大学医学动物中心。

试药与仪器：新塔花全草购自亳州市中正中药材饮片有限公司，并由专人鉴定；HE 染色试剂盒、阿托伐他汀购自北京Solarbio 公司；逆转录试剂盒、蛋白Marker 购自美国Thermo 公司；Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司；荧光定量PCR 试剂盒购自德国Qingen 公司。

新塔花水提物的制备：取干燥新塔花24.0 g，粉碎后置于圆底烧瓶中，加入200 ml 蒸馏水，加热回流2 h，水提率为75%。洗涤滤渣，将所得有效水提物继续真空悬蒸加热1 h，得新塔花水提物80 ml，定容至100 ml 即为所需新塔花高剂量（含生药0.18 g/ml），稀释1 倍为低剂量（含生药0.09 g/ml）。

模型的建立[11]：所有小鼠SPF 级环境适应性喂养1 周后，高脂饲料继续喂养12 周用于建立动脉粥样硬化模型。高脂饲料配方：基础饲料82.68%，猪油10%，猪胆盐0.2%，胆固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%。

分组及给药：适应性喂养结束后，将C57 小鼠设为空白对照组；ApoE-/-小鼠随机分为模型组、他汀组、新塔花高剂量组和新塔花低剂量组，每组10只。同时给予5 组小鼠每天灌胃1 次，持续12 周：空白对照组和模型组均给予蒸馏水（0.4 ml/10 g），他汀组给予阿托伐他汀[3.0 mg/（kg·d）]，新塔花高剂量组给予新塔花水提物[1.8 g/（kg·d）]，新塔花低剂量组给予新塔花水提物[0.9 g/（kg·d）]。小鼠给药量根据公式g/（kg·d）=9.1×成人临床药量[g/（kg·d）]换算；每周根据小鼠体质量变化调整剂量。

体质量变化观察：在小鼠灌胃前及灌胃第2 周、6 周、12 周称取体质量并记录，后期分析各组小鼠体质量变化情况。

标本采集：小鼠灌胃第12 周末，禁食不禁水12 h，麻醉后无菌条件取胸主动脉置于4%多聚甲醛固定，之后HE 染色，用于病理切片实验观察小鼠主动脉病理变化；腹主动脉置于冻存管中迅速投入液氮，转至-80 ℃冰箱，用于检测Toll 样受体-4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）的信使RNA（mRNA）相对表达水平和TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白表达水平。

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：取冻存管内小鼠主动脉组织，依次经过Trizol 法提取RNA、浓度测定、逆转录、qRT-PCR 等步骤。由生工生物工程（上海）股份有限公司设计β-肌动蛋白（β-actin）、TLR4、NF-κB 引物序列：β-actin上 游5'-TGGCACCCAGCACAATGA A-3'，下 游5'-CTA AGTCATAGTCCGCCT AGAAGCA-3'；TLR4 上游5' -GTT CTT CTC CTG CCT GAC-3'，下游 5'-TGC TGA GTT TCT GAT CCA T-3'；NF-κB上 游5'-CCCAGGGTATGGCTACTC-3'，下 游5'-CATCACTCTTGGCACAATCT-3'。以 β-actin作为内参，通过2-△△Ct法比较各组小鼠腹主动脉组织中TLR4、NF-κB 的mRNA 相对含量。

Western Blot 法：取冻存管内主动脉组织，经过提取蛋白、浓度测定、蛋白定量、凝胶电泳制备、上样、电泳、转膜、免疫反应、显色、终止、拍照等实验步骤。后期运用Image J 处理软件分析目的条带的灰度值，计算TLR4、磷酸化NF-κB p65 与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的相对表达量。

统计学方法：数据采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较用单因素方差分析，方差齐两两比较LSD 检验；方差不齐采用非参数检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量变化（表1）

灌胃第2、6、12 周末，空白对照组小鼠饮食、饮水及二便正常，体质量增加不显著；与空白对照组比较，模型组小鼠对外界刺激反应迟钝，饮食、饮水降低明显，体质量增加明显，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，他汀组、新塔花高剂量组小鼠对外界刺激反应有所缓解，饮食、饮水减少，平均体质量减少，差异均有统计学意义（P均＜0.01）；新塔花低剂量组小鼠体质量较模型组减少，但较他汀组增加（P均＜0.05）。

表1 各组小鼠体质量变化（g,±s）

表1 各组小鼠体质量变化（g,±s）

注：与空白对照组比**P＜0.01；与模型组比△P＜0.05，△△P＜0.01；与他汀组比▲P＜0.05

2.2 各组小鼠胸主动脉病理形态结构（图1）

HE 染色结果可见，空白对照组小鼠胸主动脉壁未见明显平滑肌细胞增生，腔内未见胆固醇结晶形成或明显狭窄（图1A）；模型组小鼠胸主动脉内斑块增多，动脉壁厚度明显不均匀，局部发生钙化，外膜可见大量炎性细胞浸润及斑块形成（图1B）；他汀组小鼠胸主动脉壁厚度不均，内膜增厚较模型组轻，且有少量斑块形成且稳定（图1C）；新塔花高剂量组小鼠主动脉管壁厚度不均匀，内膜增厚较模型组轻，外膜内可见少量炎性细胞浸润及斑块形成（图1D）；低剂量组管腔壁厚度不均，内膜增厚明显，可见斑块形成，病理改变较模型组未见明显改变（图1E）。

2.3 各组小鼠腹主动脉TLR4、NF-κB 的mRNA 的相对表达水平情况（图2）

qRT-PCR 结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠主动脉TLR4 mRNA[（1.04±0.38）vs（7.54±1.76），P＜0.01]、NF-κB mRNA[（1.07±0.16）vs（5.93±1.70），P＜0.01]相对表达水平升高；与模型组比较，他汀组、新塔花高剂量 组TLR4 mRNA[（7.54±1.76）vs（2.05±0.57），P＜0.01；（7.54±1.76）vs（3.84±1.06），P＜0.05]、NFκB mRNA[（5.93±1.70）vs（1.79±0.63），P＜0.01；（5.93±1.70）vs（2.04±0.94），P＜0.01]相对表达水平降低，新塔花低剂量组NF-κB mRNA[（5.93±1.70）vs（4.35±1.41），P＜0.01]相对表达水平下调；与他汀组比较，新塔花高剂量、低剂量组TLR4 mRNA[（2.05±0.57）vs（3.84±1.06）；（2.05±0.57）vs（5.94±2.04）]、NF-κB mRNA[（1.79±0.63）vs（2.04±0.94）；（1.79±0.63）vs（4.35±1.41）]相对表达水平较高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图1 各组小鼠胸主动脉苏木精-伊红染色结果（×200，n=10）

图2 各组小鼠腹主动脉TLR4、NF-κB 的mRNA 相对表达水平情况（±s,n=6）

2.4 各组小鼠腹主动脉中TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白相对表达水平比较（图3）

Western Blot 结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠腹主动脉TLR4 [（0.68±0.16）vs（1.35±0.11），P＜0.01]、磷酸化NF-κB p65[（0.61±0.08）vs（1.42±0.14），P＜0.01]蛋 白相对表达水平上调；与模型组比较，他汀组、新塔花高剂量和低剂量组TLR4 [（1.35±0.11）vs（0.90±0.10）；（1.35±0.11）vs（0.81±0.10）；（1.35±0.11）vs（0.84±0.12）]、磷 酸 化NF-κB p65 [（1.42±0.14）vs（0.88±0.08）；（1.42±0.14）vs（0.92±0.14）；（1.42±0.14）vs（1.21±0.13）]蛋白相对表达水平下调，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图3 各组小鼠主动脉TLR4、P-p65 蛋白相对表达水平的比较（±s,n=5）

3 讨论

近些年，心血管疾病已成为全球人口死亡的首要原因，其发病率呈升高趋势，目前我国心血管病现患人数 2.9 亿，而动脉粥样硬化是缺血性心血管疾病的主要病理因素[12-13]。研究表明，动脉粥样硬化在不同的病理生理过程始终伴随炎症反应。当组织受损时，诱导免疫反应从而激活TLR4，介导下游因子，激活NF-κB 磷酸化，诱导产生一系列炎性因子，从而发生炎症反应，导致内皮功能障碍，促使动脉粥样硬化的发生发展[14-17]。

众所周知，他汀类药物具有调脂、抗炎等效果，能有效抗动脉粥样硬化，降低心血管疾病患者心血管事件的发生风险。本研究结果显示，高脂饲料喂养可成功建立动脉粥样硬化小鼠模型，而新塔花高剂量组小鼠体质量较模型组降低，主动脉炎性浸润及脂质沉淀减少，未见明显斑块，血管内皮病理情况缓解，提示新塔花能够降低动脉粥样硬化小鼠体质量，改善内皮功能，减轻炎症反应。本研究还发现，新塔花高剂量组小鼠腹主动脉TLR4、NFκB mRNA 相对表达水平较模型组降低；TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白相对表达水平较模型组下调，与阿托伐他汀组比较，差异无统计学意义，这提示新塔花可能是通过降低TLR4/NF-κB 信号通路内蛋白水平，最终达到抑制炎症反应，防治动脉粥样硬化的效果。本研究结果还表明，新塔花作用程度虽然未达到他汀类药物的效果，但同样具有抑制炎症、改善内皮作用，且新塔花高剂量组比低剂量组效果更加明显，提示新塔花作用于小鼠主动脉TLR4/NF-κB 通路时，具有一定的药物剂量依赖性。

总之，该实验对新塔花应用于防治动脉粥样硬化性心血管疾病进行了探索和支持。但是，新塔花哪些成分起到了靶向作用，还需进一步对药效学和机制展开研究。