结核分枝杆菌LysA蛋白抑制剂筛选模型的建立

林 源，崔烨挺，马雪磊，马存玲，张 炜，杨延辉

（宁夏医科大学，宁夏 银川 750004）

结核病（tuberculosis，TB）是危害全球人类健康的重大传染病之一。T B 的病原体是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。据WHO报道，在 2017年，全球有大约1010万TB新发病例，130万人死于TB。近年来，结核耐药性问题日趋严重，福平耐药患者和耐多药结核病患者数量逐年增多，耐药MTB导致现有的抗结核药物治疗失效[1]，寻找结核药物新靶标和开发全新结构的抗TB药物成为当务之急。针对MTB的生存必需基因开发新型药物先导化合物是目前研发抗TB药物的重点[2-3]。LysA是MTB赖氨酸生物合成途径中的关键酶，可催化内消旋二氨基庚二酸（meso-diaminopimelate，DAP）合成为L-赖氨酸[4-5]。L-赖氨酸对MTB的生长发育是必不可少的，所以筛选靶向LysA的抑制剂有望成为新的TB药物[6-7]。我们的实验将针对原核表达的有酶活性的LysA进行虚拟筛选，获得潜在的新型抗结核药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 酶标仪购于美国Bio-TEK公司。

1.1.2 试剂 LysA为本实验室经原核表达并纯化。

1.2 方法

1.2.1 茚三酮法测定LysA的活性 虚拟筛选前验证LysA的活性，LysA在酸性环境下催化DAP转化为L-赖氨酸，L-赖氨酸与水合茚三酮共热时生成蓝紫色的二酮茚胺，在570 nm有最大吸收峰。测定的吸光度与L-赖氨酸浓度成正比，并由此推算出LysA的酶活性；为排除底物对活性测定的影响，设置一组不加底物；为排除酶自身及溶液中盐离子对茚三酮的影响，设置一组不加酶；为排除其他杂蛋白对活性测定的影响，取与样品组相同量的酶100 ℃、10 min做灭活处理。

1.2.2 虚拟筛选

使用MOE软件，将MTB的LysA酶晶体结构1hkv中赖氨酸结合位点的活性口袋区域作为受体的对接区，对1286个已经上市的药物小分子为基础进行筛选，选取对接分数最高的前4个分子，以酶活测定体系为基础评价抑制率。

2 结 果

2.1 酶活性测定

将酶标仪在570 nm处测定的吸光度（2.707）与氨基酸测定标准曲线进行比对，生成的含氮量为76.37 μg，经转化计算纯化提取得到的酶活力为503.38 U/10 μL。无底物组、无酶组和酶失活组、空白对照组无颜色变化，在570 nm处的吸光值近于零，因此排除杂蛋白干扰。

2.2 虚拟筛选与抑制剂的确定

通过与MTB LysA晶体的赖氨酸结合位点（图1）进行分子虚拟对接，从成药库中筛选得到了4个对接打分显著优于赖氨酸本身的已有药物，分别是nadide、acarbose、sennoside A和lanatoside C，经评价acarbose对LysA的酶抑制率最高，可达64.3%（表1）。

3 讨 论

MTB的赖氨酸生物合成途径是从L-天冬氨酸开始经历9步酶促反应最终合成L-赖氨酸，最后一步是由LysA /DAPDC催化发生脱羧反应，将底物DAP合成为L-赖氨酸。Dahl，Christiane等人已经纯化得到了此酶，但并未测定其生物学活性，本课题在其基础上测定LysA的活性，为抗结核药物的筛选奠定基础。

LysA由MTB的Rv1293基因编码，是MTB L-赖氨酸合成所需要的关键酶。靶向结合LysA的化合物可能干扰细菌L-赖氨酸合成，继而抑制细菌的生长繁殖[8]。我们用MOE软件虚拟筛选得到了4个LysA的抑制剂，其中acarbose对LysA的酶抑制率最高，可达64.3%。

表1 虚拟对接打分与酶抑制率

Acarbose（阿卡波糖）是临床上常用的降血糖药物，可以与其他降血糖药或胰岛素联合应用于糖尿病的治疗。我们经筛选发现了Acarbose对LysA也具有一定的抑制作用，理论上也具有抗结核分枝杆菌的作用，可作为抗结核候选药物进一步进行研究。