醋酸钠林格液对失血性休克大鼠心肌炎性介质及NF-κB、MAPK信号通路的影响

王振杰，徐志鹏，陈 硬，宋 琦

创伤失血性休克(THS)是创伤导致死亡最主要的原因之一[1]。严重失血、凝血功能障碍和严重感染以及继发造成的全身炎症反应综合症及多器官功能障与死亡率直接相关[2]，有效控制出血和液体复苏是提高生存率的主要治疗措施。既往研究[3]表明，液体复苏有益于THS组织灌注的恢复、组织缺氧的预防、细胞因子作用的减弱以及组织细胞凋亡的减少等。THS继发的心肌损伤具有较差的生存率[4]，其机制尚不完全清楚，但心肌细胞中基因异常上调可调控相关蛋白和炎症因子的表达，包括核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素(IL)-6等[5]。发生THS后，NF-κB激活炎症级联反应，加快促炎因子如TNF-α的释放[6]。研究[7-8]表明，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活对于失血性休克所致急性肝、肺损伤发挥重要介导作用，但其在THS所致心肌损伤中的研究较少。最近一项研究[9]表明，炎症介质的体外释放受到MAPKs影响，如c-Jun NH2-末端激酶(JNK)、p38MAPK和细胞外信号调节激酶(ERK)。JNK在介导IL-6和TNF-α的表达中发挥重要作用[10]。MAPK磷酸酶(MKP-1)可通过去磷酸化导致包括JNK在内的MAPK失活，调节MKP-1表达的机制对于确定MAPK磷酸化的持续时间和免疫应答至关重要[11-12]。本研究旨在探讨NF-κB、MKP-1及JNK在THS相关心肌损伤进展中的潜在作用，探讨醋酸钠林格液相对常规复苏液乳酸钠林格液及对THS的早期复苏效果，并进一步验证通过调控NF-κB和MAPK信号表达保护THS相关心肌损伤的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康SD大鼠32只，SPF级，雌雄不限，体质量(300±20)g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供(上海，中国)。实验动物于室温(22±1)℃、湿度45%～55%、12 h光照/黑暗周期条件下饲养7 d。醋酸钠林格液购于湖南康源制药有限公司(浏阳，中国)，0.9%氯化钠溶液及乳酸钠林格液购于安徽环球药业股份有限公司(蚌埠，中国)，Trizol、UltraPure Agarose、Sybr qpcr mix、SuperScript Ⅲ RT 反转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，JNK抗体、MKP-1抗体、p65(Ser536)抗体、p65(Lys310)抗体购于MDL公司(北京，中国)。

1.2 方法 SD大鼠随机分为失血性休克未复苏组(CR组)、0.9%氯化钠溶液复苏组(NR组)、乳酸钠林格液复苏组(LR组)和醋酸钠林格液复苏组(AR组)，各8只。4组大鼠均制备失血性休克模型：腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，大鼠双侧腹股沟区备皮、消毒、铺巾，分离股动脉和股静脉。右侧股动脉置管连接MedLab-U/4C501H生物信号采集处理系统，监测平均动脉压(MAP)(2.5%枸橼酸钠冲洗测压系统)，左侧股动脉置管放血制作休克模型，右侧股静脉置管用于液体复苏，左侧股静脉连接微量泵。置管后适应20 min，用1 mL注射器(已预先填充枸橼酸钠溶液0.1 mL)从左侧股动脉以2 mL/3 min速度缓慢放血，直到MAP达30 mmHg，此过程大概需要20 min。通过缓慢回输自体血或少量缓慢放血维持MAP(30 mmHg)60 min后，NR组、LR组和AR组大鼠经右侧股静脉分别泵入0.9%氯化钠溶液、乳酸钠林格液、醋酸钠林格液(速度<20 mL/h)，CR组诱导休克后不予以复苏，观察4 h。复苏组(NR组、LR组和AR组)液体复苏成功后(MAP维持在80 mmHg)，观察4 h，处死大鼠，取心组织置于-80 ℃冰箱保存。本实验经蚌埠医学院实验动物管理和伦理委员会批准进行。

1.3 观察指标

1.3.1 实时荧光定量PCR法检测大鼠心肌组织TNF-α mRNA、IL-4 mRNA及IL-10 mRNA相对表达量 用Trizol试剂盒提取大鼠心肌组织RNA：反转录应用Invitrogen反转录试剂盒superscript Ⅲ配制反应液，65 ℃灭活10 min去DNA，加入引物混合物，42 ℃逆转录60 min，置于85 ℃反应10 min，灭活逆转录酶。反应结束后置-20 ℃待用。将cDNA稀释10倍，作为PCR模板加入引物反应体系，于ABI 7900 qPCR仪上，按照95 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，进行40个循环，读取Ct值并计算2-ΔΔCt，得到结果。各引物序列见列表1。

表1 目的基因引物序列

1.3.2 Western blotting法检测大鼠心肌组织JNK磷酸化、MKP-1乙酰化、p65(Ser536)磷酸化和P65(Lys310)乙酰化蛋白相对表达量 取冷冻保存的大鼠心肌组织，加入裂解液作用1 min，离心30 min，取上清即细胞总蛋白置于-80 ℃冰箱冻存备用。使用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，蛋白经SDS-PAGE 分离后通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白转印至PVDF膜。经5%脱脂奶粉室温封闭120 min后，加入相应一抗4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次，加入碱性磷酸酶(AP)标记的二抗室温孵育60 min，TBST 洗膜3次，ECL化学发光、显影、定影、拍照。计算目的蛋白与β-actin灰度值比值，进行统计学分析。

1.3.3 大鼠心肌组织病理学检查 大鼠心肌组织经10%甲醛溶液内固定，石蜡包埋且卡片，HE染色，在光镜下进行心肌组织形态学观察。

1.4 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织形态学观察 诱导休克维持4 h后，CR组大鼠心肌细胞混浊肿胀，间质水肿明显，可见红细胞外渗；复苏成功后维持4 h，AR组大鼠心肌组织损伤程度较NR组和CR组明显改善(见图1)。

2.2 4组大鼠心肌组织相关细胞因子mRNA表达水平比较 THS复苏成功4 h后，NR组、LR组和AR组大鼠心肌组织TNF-α mRNA表达水平均明显低于CR组(P<0.01)，LR组和AR组IL-10 mRNA均高于CR组(P<0.05和P<0.01)，AR组IL-4 mRNA均明显高于LR组、NR组和CR组(P<0.01)(见表2)。

分组nIL-4 mRNA IL-10 mRNA TNF-α mRNA CR组80.63±0.73 0.49±0.35 11.92±7.81 NR组81.45±1.142.46±1.454.33±2.72∗∗LR组82.53±0.726.07±4.46∗3.27±1.59∗∗AR组86.97±4.39∗∗##ΔΔ7.81±6.04∗∗#1.33±0.80∗∗F—11.82 6.07 9.63 P—<0.01 <0.01 <0.01 MS组内—5.406 14.650 17.891

q检验：与CR组比较*P<0.05，**P<0.01；与NR组比较#P<0.05，##P<0.01；与LR组比较ΔΔP<0.01

2.3 4组大鼠心肌组织p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙酰化和JNK磷酸化、MKP-1乙酰化蛋白相对表达量比较 复苏成功4 h后，复苏组大鼠p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙酰化、JNK磷酸化蛋白相对表达量均低于CR组(P<0.05～P<0.01)，且AR组均低于NR组和LR组(P<0.05～P<0.01)；复苏组MKP-1乙酰化蛋白相对表达量均高于CR组(P<0.05～P<0.01)，且AR组和LR组均明显高于CR组(P<0.01)(见图2、表3)。

3 讨论

全球每年大约有190万人因失血导致死亡，其中150万人死于创伤所致[3,13]。尽管随着急救模式的不断改进和休克复苏指南的普及学习，失血性休克早期复苏成功率有了较大提高，但后期死亡率仍然居高不下，这可能与休克诱发机体细胞因子和炎性介质失控性释放，并由此介导全身炎症反应综合症、组织细胞损伤甚至多器官功能障有关[14]。创伤后继发性心脏损伤是创伤病人预后的一个关键因素，但其机制尚未完全阐明。本研究通过建立THS模型，明确了NF-κB及MAPK信号通路在心肌炎症损伤过程中发挥重要作用。

p50和p65是NF-κB在经典激活途径中研究最为常见的2个二聚体，并且p50和p65的激活与细胞存活和炎症反应的发生密切相关[15]。在细胞和组织遭受各种刺激或者损伤时可诱导p65发生磷酸化，特别是p65丝氨酸536位点磷酸化已成为转录激活新机制[16]。p65(Ser536)磷酸化通过增加组蛋白乙酰化酶与p65的结合进而促进p65(Lys310)乙酰化。p65乙酰化可增强与DNA 的结合能力，继而增强NF-κB 对促炎因子的调控[17]。因此，本研究测定p65(Ser536)磷酸化及p65(Lys310)乙酰化蛋白相对表达量来反映不同复苏液复苏对大鼠促炎核转录因子活性影响。

表3 4组大鼠p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙酰化、JNK磷酸化和MKP-1乙酰化蛋白相对表达量比较

q检验：与CR组比较*P<0.05，**P<0.01；与NR组比较#P<0.05，##P<0.01；与LR组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

MAPK在受到细胞外多种刺激因素和信号分子，如缺血再灌注损伤、细胞因子、神经递质、激素等刺激后，发生磷酸化而活化，并将细胞外界刺激信号放大并转导至细胞质或细胞核内，驱动下游细胞因子以转录和非转录方式激活导致不同的细胞内反应[18-19]。JNK作为MAPK家族一员，其信号表达在维持细胞正常状态和应激表达过程中发挥关键的调控作用[20-21]。MKP-1作为p38MAPK和JNK的底物，通过去磷酸化作用使MAPK失活，MKP-1表达机制的干预对于MAPK磷酸化的持续过程及免疫应答的反应时间至关重要[22]。因此，本研究测定JNK磷酸化及MKP-1乙酰化表达水平来反映不同复苏液复苏对大鼠MAPK信号通路的影响。

创伤性损伤后立即治疗和抗休克处理已成为现代创伤救治的关键措施。除了手术控制出血外，液体复苏仍然是最重要的挽救生命的干预措施之一，并且有证据[23]表明，对于大多数低血容量病人，推荐晶体液作为一线复苏液体。然而关于最佳晶体液的选择，临床一直存有较大争议。近来研究[24]表明，醋酸钠林格液林格液作为一种新型平衡盐溶液，与0.9%氯化钠溶液及乳酸钠林格液相比，能够维持较高碳酸氢盐水平及降低碱缺乏量，较少导致高血糖。有研究表明，在脂多糖诱导的小胶质细胞的炎症反应中，醋酸钠能够抑制p38和JNK的磷酸化，来抑制促炎细胞因子表达及提升抗炎细胞因子的水平进而减轻其小胶质细胞的炎症[25]。本研究结果显示，与0.9%氯化钠溶液和乳酸钠林格液比较，采用醋酸钠林格液复苏失血性休克大鼠，可明显降低p65(Ser536)磷酸化及p65(Lys310)乙酰化表达水平。提示醋酸钠林格液能够下调失血性休克大鼠心组织p65(Ser536)磷酸化水平，从而阻止组蛋白乙酰化酶与p65结合，进而逆转了p65(Lys310)乙酰化。同时，醋酸钠林格液复苏失血性休克大鼠可提高大鼠心肌组织MKP-1乙酰化表达水平及降低JNK磷酸化表达水平。经醋酸钠林格液复苏后，大鼠TNF-α表达水平明显低于休克未复苏组，我们推测醋酸钠林格液通过抑制NF-κB及MAPK信号转导，减少下游致炎因子的释放。

此外，IL-4和IL-10作为2种重要的抗炎因子均能够通过下调炎性介质包TNF-α和IL-1等，促进体液免疫反应[26]。动物研究[27]表明，IL-10水平升高可以保护心脏细胞免受急性心肌炎的损害。本研究结果显示，与乳酸钠林格液和0.9%氯化钠溶液比较，醋酸钠林格液复苏失血性休克大鼠可以明显提高IL-4 mRNA表达水平，IL-10 mRNA表达水平亦明显高于0.9%氯化钠溶液，说明醋酸钠林格液能够逆转促炎因子和抗炎因子表达失衡，从而保护心肌损伤。

综上，醋酸钠林格液复苏失血性休克大鼠，可通过抑制NF-κB及MAPK途径减少致炎因子TNF-α水平，同时可以增加抗炎因子IL-4和IL-10水平来保护休克造成的心肌损伤。但该结论仍需要进一步的基础研究和临床研究加以证实。