一株邻苯二甲酸酯降解菌Salipiger sp.D13基因组特征及其降解能力

刘洋 饶秋华 黄敏敏 罗土炎

摘 要：为了明确菌株Salipiger sp.D13对邻苯二甲酸酯（Phthalates esters，PAEs）的降解特性，对菌株Salipiger sp. D13基因组序列和对邻苯二甲酸酯的降解能力进行研究;同时，根据关键酶基因和中间代谢物，推测Salipiger sp. D13代谢邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）的完整途径。试验结果表明：菌株Salipiger sp. D13含有降解邻苯二甲酸酯的关键酶基因，分布在多环芳烃降解和苯甲酸代谢等代谢途径中，对6种优先级控制PAEs的5 d降解率均在90%以上;菌株Salipiger sp. D13降解邻苯二甲酸酯二丁酯（DBP）的完整途径为邻苯二甲酸二丁酯通过酯酶水解为邻苯二甲酸（PA），PA通过加氧酶、脱氢酶、脱羧酶生成原儿茶酸（PCA），PCA通过原儿茶酸3，4加氧酶（protocatechuate 3，4dioxygenase）开环，形成βcarboxymuconate等物质，从而进入三羧酸循环。试验结果可为菌株Salipiger sp.D13用作邻苯二甲酸酯类污染环境生物修复的候选菌株提供理论基础。

关键词：邻苯二甲酸酯;内分泌干扰毒性;盐懒惰菌属;生物降解;代谢通路

中图分类号：X592 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）02-0001-08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.02.001

Abstract：In order to clarify the degradation characteristics of the strain of Salipiger sp. D13 on phthalates， the genomic sequence of Salipiger sp. D13 and the degradation ability of this strain on phthalates were analyzed. Meanwhile， according to the key enzyme gene and intermediate metabolites， the complete pathway of Salipiger sp. D13 to metabolize DBP was speculated. The results showed that the strain of Salipiger sp. D13 contained the key enzyme genes for the degradation of phthalates， which were distributed in the metabolic pathways such as the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and the metabolism of benzoic acid， and the 5day degradation rates of the six priority controlled PAEs by the strain of Salipiger sp. D13 were all above 90%. The complete pathway of Salipiger sp. D13 to degrade dibutyl phthalate was that：dibutyl phthalate was hydrolyzed to phthalic acid （PA） by esterase.3， and PA produced protocatechuic acid （PCA） by oxygenase， dehydrogenase and decarboxylase， and then PCA was hydrolyzed to the substances such as βcarboxymuconate by ring opening reaction with protocatechuate 3，4dioxygenase， which were then delivered to the tricarboxylic acid cycle. The experimental results could provide a theoretical basis for the application of Salipiger sp. D13 as a candidate strain for the environmental bioremediation of phthalate ester pollutants.

Key words：Phthalate esters;Endocrine disruption toxicity;Salipiger;Biodegradation;Metabolic pathway

邻苯二甲酸酯（Phthalates esters，PAEs）是一种典型环境内分泌干扰物，主要用作增塑剂，被广泛应用于增大产品的可塑性和提高产品的强度中[1]，PAEs具有类雌激素毒性，对人體产生内分泌干扰作用。20世纪末人们开始意识到内分泌干扰物的危害[2]，而后大量的研究表明，PAEs具有致畸、致癌、破坏免疫力和生殖功能等毒性[3-5]。而PAEs作为增塑剂并非共价聚合到塑料产品的基质中，而是由氢键或范德华力连接到聚烯烃类塑料分子之间，保留其相对独立的化学性质。PAEs可由塑料中迁移到外环境，造成环境污染[6]，塑料制品等的大量应用导致PAEs在环境中无处不在。目前，PAEs在全球的生态环境中已达到了普遍检出的程度，在土壤、河流、湖泊、海洋底质、饮用水、垃圾场乃至食品中都能检测到PAEs的存在[7-10]，PAEs已成为全球最普遍的污染物之一。

微生物降解被认为是自然环境中PAEs完全矿化的主要过程[11]。盐懒惰菌属（Salipiger）最早由MartínezCánovas等[12]提出，目前该属包含7个种（https：//lpsn.dsmz.de/genus/salipiger），是玫瑰杆菌类群（Roseobacter clade bacteria，RCB）的重要组成单元，在有机物矿化和异源物质代谢循环中发挥着重要作用，如海洋碳源循环[13]，硫元素循环[14]等。课题组从深海沉积物中分离出能以邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）和邻苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DnBP）为唯一碳源生长的菌株，通过16S rRNA基因序列确定其隶属于盐懒惰菌属[15]。本研究拟通过对该菌株基因组功能及其降解PAEs能力的研究，为该菌株在环境内毒素——邻苯二甲酸酯微生物降解应用方向提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株分离自深海沉积物，由本实验室鉴定并保藏于海洋微生物菌种保藏管理中心（Marine Culture Collection of China，MCCC），保藏号为1K02156。

1.2 主要仪器

GCMSTQ8040气相色谱三重四级杆质谱仪（日本岛津公司）;HGC36A氮吹仪（中国天津恒奥有限公司）;KQ500DE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）;Anke TDL5A离心机（上海安亭科学仪器厂）;涡旋振荡器（德国IKA公司）;AL204电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 主要试剂药品

邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP），邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP），邻苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DnBP），邻苯二甲酸丁苄酯（butyl benzyl phthalate，BBP），邻苯二甲酸二（2乙基己基）酯[di（2ethylhexyl） phthalate，DEHP]和邻苯二甲酸二辛酯（dinoctyl phthalate，DnOP） 6种优先控制级邻苯二甲酸酯标准品（stanquick， Stanford Analytical Chemicals Inc.，纯度均>98%）;正己烷（德国 Merck 公司，色谱纯）;其余试剂无特殊说明均为分析纯。

1.4 主要培养基

2216E培养基购自于青島海博生物有限公司;PAEs底物的无机盐培养基（mineral salt medium，MSM）：（NH4）2SO4 1000 mg·L-1，KH2PO4 200 mg·L-1，K2HPO4 800 mg·L-1，MgSO4·7H2O 500 mg·L-1，FeSO4 10 mg·L-1，CaCl2 50 mg·L-1，NiSO4 32 mg·L-1，Na2BO7·H2O 7.2 mg·L-1，（NH4）6Mo7O24·H2O 14.4 mg·L-1，ZnCl2 23 mg·L-1，CoCl2·H2O 21 mg·L-1，CuCl2·2H2O 10 mg·L-1，和MnCl2·4H2O 30 mg·L-1，pH为7，于121℃下高压蒸汽灭菌 20 min。固体培养基加琼脂 18.0 g·L-1。

1.5 试验方法

1.5.1 基因组数据分析 菌株Salipiger sp.D13基因组测序与拼接参见作者已发表文章[15]。通过Prodigal version 2.5软件对编码基因进行预测，借用蛋白质功能数据库COG（Clusters of Orthologous Groups）和代谢通路数据库KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）等功能数据库与该基因组预测的氨基酸序列逐一进行比对，分别对其蛋白质功能和生物学代谢通路进行预测，其他相关基因单独提取并注释。

1.5.2 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 ①单标储备液：分别准确称取 10 mg （精确至 0.01 mg） 各药剂标准品，用正己烷溶解并定容于 10 mL 容量瓶中，配成1000 mg·L-1的单标储备液，于-20℃保存。②混合标准工作液：分别移取0.1 mL单标储备液，用正己烷稀释并定容于10 mL容量瓶中，配成10 mg·L-1的混合标准工作液，于-20℃保存。③空白基质匹配标准工作溶液：准确移取一定量的混合标准工作液，用空白样品提取液稀释为25、50、250、500、1000 ng·mL-1的系列工作液，配制成系列空白基质匹配标准溶液，现配现用。外标法定量。以峰面积为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标，绘制工作曲线。

1.5.3 PAEs降解 将菌株D13接种到2216E培养基，28℃、180 r·min-1培养12 h，4℃、4000 r·min-1离心收集细胞，用无机盐液体培养基重悬至菌液浓度OD 600约为1.0，以此作为种子液，按2%接种量接种到三角瓶中（装液量50 mL/250 mL），考察该菌株对不同底物（DMP、DEP、DBP、BBP、DnOP、DEHP，分别为50 mg·L-1）5 d降解率，设置不接种微生物的试验作为对照组，并测定DBP中间代谢物。

1.5.4 PAEs提取 参考王敏等[16]的方法，向50 mL含有不同邻苯二甲酸酯底物的无机盐培养液中加入萃取液正己烷20 mL，放入涡旋振荡器震荡20 min，超声仪中萃取30 min，离心分层后取出有机相，再加入20 mL正己烷萃取2次，将3次获得的有机相混合;将混合液进行N2吹浓缩，用10 mL容量瓶定容;过0.22 μm有机膜，4℃保存待分析。

1.5.5 GCMS测定PAEs及其降解产物 色谱条件：Rxi5 Sil MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;进样口温度250℃;柱温：柱温箱初始温度为60℃，以15℃·min-1升至200℃，保持2 min，再以 10 ℃·min-1升至280℃，保持5 min;不分流进样;进样量 1 μL;载气为高纯氦气（99.999%），流速1 mL·min-1。

质谱条件：电子轰击离子源 （EI源）;电子轰击中能70 eV;检测器电压1.14 Kv;离子源温度200℃;接口温度250℃;溶剂延迟2.5 min。

检测方式：SCAN（全扫描），扫描时段3.00～33.00 min，扫描质量范围：45～500，扫描间隔：0.5 s。采用全扫描谱库检索与相应保留时间提取质量色谱图进行特征选择离子定性相结合方法定性。

2 结果与分析

2.1 基因组特征

Salipiger sp.D13基因组序列在GenBank上的登录号为RAPJ00000000。该菌株基因组测序深度为152，全长为5 217 351 bp，（G+C）%含量为66.7%，无质粒等遗传物质。

2.1.1 COG功能分类 根据Glimmer（http：//ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml）对基因组的注释结果，得到3127个已知基因序列。在与COG数据库BLASTp比对之后，有90.03%的CDS序列得到功能分类，如图1所示，其中具有次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢（Q）功能的基因共有111个，具有细胞内物质转运、分泌和膜泡运输（U）功能的基因有78个，具有碳水化合物的运输和代谢（G）功能的基因共有301个，这些基因可能与该菌株降解邻苯二甲酸酯的功能密切相关。

2.1.2 KEGG代谢通路分类 根据KEGG对菌株D13的分析结果可知，参与异型生物质生物降解和代谢的基因有88个，其中27个基因参与苯甲酸代谢通路（图2）。PAEs代谢最常见的步骤是从脱酯化作用开始[17]，菌株D13含有5个酯酶（esterases）可能参与邻苯二甲酸酯酯键的水解，生成重要的中间代谢产物邻苯二甲酸（phthalic acid，PA）;然后通过4，5邻苯二甲酸双加氧酶作用于PA，生成顺4，5二羟4，5二氢邻苯二甲酸酯（cis4，5dihydroxy4，5dihydrophthalate），再生成4，5双羟基邻苯二甲酸酯（4，5dihydroxyphthalate），最后转化为原儿茶酸（Protocatechuate，PCA）[18-19];原儿茶酸的环裂解由内二醇环裂解双加氧酶或外二醇环裂解双加氧酶等介导，分别产生3羧基粘康酸或4羧基2羟基粘康酸半醛，再将3羧基粘康酸转化为β酮己二酸并进入β酮己二酸途径，或将4羧基2羟基粘康酸半醛分解成草酰乙酸和丙酮酸，最终进入三羧酸循环[19]。菌株Salipiger sp.D13含有dioxygenase， 4，5dihydroxyphthalate dehydrogenase，4，5dihydroxyphthalate decarboxylase，protocatechuate 3，4dioxygenase，intradiol ringcleavage dioxygenase等参与中间代谢物邻苯二甲酸和原儿茶酸的酶，主要分布于多环芳烃降解（Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation）和苯甲酸代谢（Benzoate degradation）代谢途径。

2.2 PAEs标准曲线

以6种邻苯二甲酸酯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线如图3所示，通过拟合得到的直线回归方程如表1所示，R2均大于0.99，拟合效果较好。

2.3 GCMS 测定PAEs降解率及其降解产物

2.3.1 PAEs降解率 根据PAEs起始浓度、回收率，将终浓度代入标准曲线得到6种邻苯二甲酸酯的降解率分别如表2所示，6种邻苯二甲酸酯5 d降解率均大于90%。

2.3.2 PAEs降解产物分析 在DBP降解初期，GCMS检测到MSM培养基中主要是邻苯二甲酸二正丁酯（dinbutylphthalate，DBP）。随着降解时间的增加，12～24 h间，培养基中开始检测到邻苯二甲酸单丁酯（monobutyl phthalate，MBP）和邻苯二甲酸（phthalic acid，PA）（图4）。在降解过程中，有些代谢产物如原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA），βcarboxymuconate和γcarboxymuconolactone等没有检测到，可能是由于这些中间代谢物形成后即被代谢，没有积累下来。根据DBP中间代谢产物及Salipiger sp.D13所持有的参与DBP代谢的酶，本研究推测出了一条菌株Salipiger sp.D13代谢DBP的降解途径（图5）。

3 结论与讨论

玫瑰杆菌类群（Roseobacter clade bacteria，RCB）是海洋生态系统中分布最广、数量最多的细菌类群之一，构成了近30%的海洋环境细菌群落[20]。RCB所有成员都属于α变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）中的红杆菌科（Rhodobacteraceae），它们含有丰富的功能基因和具有广泛的功能特性，如各种有机和无机化合物代谢及功能次级代谢物生产等[21-22]。

本研究从深海沉积物中分离一株能够降解邻苯二甲酸酯的细菌，盐懒惰菌属（Salipiger sp.D13）。基因组数据分析表明，菌株Salipiger sp. D13有111个基因注释到次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢（Q）上，該通路通常与异源物质的分解代谢相关。菌株Salipiger sp. D13含有与邻苯二甲酸酯降解相关的酶，如酯酶（esterases），dioxygenase，4，5dihydroxyphthalate dehydrogenase，4，5dihydroxyphthalate decarboxylase，protocatechuate 3，4dioxygenase和intradiol ringcleavage dioxygenase等等，这些酶与其他邻苯二甲酸酯降解菌株相似[23-24]，主要分布于多环芳烃降解（Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation）和苯甲酸代谢（Benzoate degradation）代谢途径。以PAEs浓度和峰面积成功绘制了标准曲线，拟合度均>0.99。PAEs（50 μg·mL-1）的5 d降解率均>90%，表明菌株Salipiger sp.D13对6种优先控制级邻苯二甲酸酯具有较好的降解能力，是邻苯二甲酸酯的广谱降解菌。与Gordonia alkanivorans subsp.YCRL2[25]相比，在降解速率和降解率（7 d降解100～800 mg·L-1 DEHP 94.0%以上）上还有差距，可能与降解条件有关，后期试验需要优化降解条件;但比Arthrobacter sp.C21具有较强的降解能力（20 mg·L-1DBP和DEHP 3 d降解率约为52%）[26]。

GCMS檢测到菌株D13降解DBP代谢产物分别为邻苯二甲酸单丁酯和邻苯二甲酸，其他代谢产物如原儿茶酸，βcarboxymuconate和γcarboxymuconolactone在发酵液中没有积累，因此没有出现相应的质谱图，这和Bacillus megaterium subsp.YJB3[27]具有相似的结果。根据检测到的中间代谢产物，结合菌株Salipiger sp. D13基因组中持有的相关酶基因，本研究为盐懒惰菌菌株Salipiger sp.D13推测出了一条完整的DBP代谢路径，即邻苯二甲酸二丁酯通过酯酶水解为邻苯二甲酸（PA），PA通过加氧酶，脱氢酶，脱羧酶生成原儿茶酸（PCA），PCA通过原儿茶酸3，4加氧酶（protocatechuate 3，4dioxygenase）开环，形成βcarboxymuconate等物质，从而进入三羧酸循环。Feng[27]等报道了Bacillus megaterium subsp.YJB3拥有一条类似的DBP代谢途径，但菌株YJB3对其他PAEs的降解能力没有数据报道;Tang等[28]也提出了Rhizobium sp.LMB1的DBP代谢途径，该菌株在代谢过程中出现了Tartaric acid中间代谢物，但在菌株Salipiger sp.D13代谢过程中没有检测到Tartaric acid中间代谢物。本研究结果表明，菌株Salipiger sp.D13具有对邻苯二甲酸二丁酯完整的代谢途径，同时对其他5种控制级邻苯二甲酸酯具有较高的降解率，该菌株可作为邻苯二甲酸酯类污染环境生物修复的理想候选菌株。

参考文献：

[1]STAPLES C A，PETERSON D R，PARKERTON TF，et al.The environmental fate of phthalate esters：A literature review[J].Chemosphere，1997，35：667-749.

[2]张建江，舒为群. 邻苯二甲酸酯雌性生殖毒性研究进展[J].卫生研究，2005，34（4）：496-498.

[3]HAUSER R，MEEKER J D， Duty S，et al. Altered semen quality in relation to urinary concentrations of phthalate monoester and oxidative metabolites[J].Epidemiology，2006，17（6）：682-691.

[4] SCHETTLER T E D.Human exposure to phthalates via consumer products[J].International journal of andrology，2006，29（1）：134-139.

[5]TYL R W，MYERS C B，MARR M C，et al.Reproductive toxicity evaluation of dietary butyl benzyl phthalate（BBP）in rats[J].Reproductive toxicology，2004，18（2）：241-264.

[6]WANG J，BO L J， LI L N，et al.Occurrence of phthalate esters in river sediments in areas with different land use patterns[J].Sci Total Environ，2014，500-501：113-119.

[7]WANG W L，WU Q Y，WANG C，et al.Health risk assessment of phthalate esters（PAEs）in drinking water sources of China[J].Environ Sci Pollut Res Int，2015，22（5）：3620-3630.

[8]ZHANG Q，SONG J M，LI X G，et al.Concentrations and distribution of phthalate esters in the seamount area of the Tropical Western Pacific Ocean[J].Mar Pollut Bull，2019，140：107-115.

[9]CHENG Z，LIU J B， GAO M，et al.Occurrence and distribution of phthalate esters in freshwater aquaculture fish ponds in Pearl River Delta，China[J].Environ Pollut，2019，245：883-888.

[10]ZHANG Z M，ZHANG H H，ZHANG J，et al.Occurrence，distribution，and ecological risks of phthalate esters in the seawater and sediment of Changjiang River Estuary and its adjacent area[J].Sci Total Environ，2018，619-620：93-102.

[11]SUN C，ZHANG G，ZHENG H，et al.Fate of four phthalate esters with presence of Karenia brevis：Uptake and biodegradation[J].Aquat Toxicol，2019，206：81-90.

[12]MARTNEZCNOVAS M J，QUESADA E，MARTINEZCHECA F，et al.Salipiger mucescens gen.nov.，sp. nov.，a moderately halophilic，exopolysaccharideproducing bacterium isolated from hypersaline soil，belonging to the alphaProteobacteria[J].Int J Syst Evol Microbiol，2004，54（5）：1735-1740.

[13]JIAO N，ZHANG Y，ZENG Y， et al.Distinct distribution pattern of abundance and diversity of aerobic anoxygenic phototrophic bacteria in the global ocean[J].Environ Microbiol，2007，9（12）：3091-3099.

[14]DURHAM B P，SHARMA S，LUO H，et al.Cryptic carbon and sulfur cycling between surface ocean plankton[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（2）：453-457.

[15]LIU Y，LUO T，LIN Q，et al.Draft Genome Sequence of Thiobacimonas sp.Strain D13，a Phthalate EsterDegrading Bacterium Isolated from DeepSea Sediments[J].Microbiol Resour Announc，2019，8（24）：e00181-19.http：//doi.org/10.1128/MRA.00181-19.

[16]王敏，汪仕韜.食品接触用塑料产品中19种邻苯二甲酸酯类增塑剂GCMS检测研究[J].塑料包装，2017，27（4）：36-41.

[17]REN L，LIN Z，LIU H，et al.Bacteriamediated phthalic acid esters degradation and related molecular mechanisms[J].Appl Microbiol Biotechnol，2018，102（3）：1085-1096.

[18]骆祝华，黄翔玲，叶德赞.环境内分泌干扰物：邻苯二甲酸酯的生物降解研究进展[J].应用与环境生物学报，2008，14（6）：890-897.

[19]沈思，王晓瑜，王海霞，等.细菌降解邻苯二甲酸酯的研究进展[J].生物工程学报，2019，35（11）：2104-2120.

[20]DANIEL R，SIMON M，WEMHEUER B.Editorial：Molecular Ecology and Genetic Diversity of the Roseobacter Clade[J].Front Microbiol，2018，9：1185.

[21]KENT A G，GARCIA C A，MARTIMNY A C.Increased biofilm formation due to hightemperature adaptation in marine Roseobacter[J].Nat Microbiol，2018，3（9）：989-995.

[22]TODD J D，KIRKWOOD M， NEWTONPAYNE S，et al.DddW，a third DMSP lyase in a model Roseobacter marine bacterium，Ruegeria pomeroyi DSS3[J].ISME J，2012，6（1）：223-226.

[23]MA D，HAO Z Y，SUN R，et al.Genome Sequence of a Typical Ultramicrobacterium，Curvibacter sp. Strain PAEUM，Capable of Phthalate Ester Degradation[J].Genome Announc，2016，4（1）：e01510-15.doi：10.1128/genomeA.01510-15.

[24]JIN D C，ZHU Y，WANG X X，et al.Draft Genome Sequence of Sphingobium yanoikuyae TJ，a Halotolerant DinButylPhthalateDegrading Bacterium[J].Genome Announc，2016，4（3）：e00569-16.

[25] NAHURIRA R，REN L，SONG J，et al.Degradation of Di（2Ethylhexyl） Phthalate by a Novel Gordonia alkanivorans Strain YCRL2[J].Curr Microbiol，2017，74（3）：309-319.

[26] WEN Z D，GAO D W，WU W M.Biodegradation and kinetic analysis of phthalates by an Arthrobacter strain isolated from constructed wetland soil[J].Appl Microbiol Biotechnol，2014，98（10）：4683-4690.

[27]FENG N X，YU J，MO C H，et al.Biodegradation of dinbutyl phthalate （DBP） by a novel endophytic Bacillus megaterium strain YJB3[J].Sci Total Environ，2018，616-617：117-127.

[28]TANG W J，ZHANG L S，FANG Y，et al.Biodegradation of phthalate esters by newly isolated Rhizobium sp.LMB1 and its biochemical pathway of dinbutyl phthalate[J].Journal of Applied Microbiology，2016，121（1）：177-186.

（责任编辑：林玲娜）