黄芩苷调控活化Toll样受体4/核因子-κB信号通路对复发性流产小鼠的影响

焦伟 崔红梅 霍叶琳 王静雅

摘要 目的：探討黄芩苷对复发性流产小鼠的影响及作用机制。方法：参照Clark经典模型构建复发性流产小鼠，并将成功构建好的小鼠随机分为模型组和实验组，每组10只;同时建立正常妊娠小鼠模型10只作为对照组。于妊娠第2天，实验组灌胃0.4 mL/mg黄芩苷，模型组和对照组灌胃等量0.9%氯化钠注射液，1次/d，连续干预7 d。酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中激素水平及母胎界面中炎性反应递质水平;免疫组织化学检测小鼠子宫组织巨噬细胞分布情况;蛋白免疫印迹法检测各组小鼠子宫组织活化Toll样受体4（TLR4）、核因子-κB、髓样分化因子88（MyD88）蛋白表达情况。结果：对照组、模型组和实验组小鼠母胎界面中TNF-α/IL-4为（2.78±0.36），（4.89±0.58）和（3.39±0.34），血清中E2为（25.16±3.69），（17.56±4.52），（22.36±4.16）ng/L。小鼠子宫组织中分化抗原14（CD14）蛋白相对表达量分别为（9.36±2.34），（68.12±13.52），（33.46±2.85）%，子宫组织中TLR4蛋白表达量为（0.23±0.02），（1.25±0.33），（0.45±0.12），核因子-κB蛋白表达量为（0.59±0.14），（1.52±0.36），（0.78±0.25），MyD88蛋白表达量为（0.63±0.24），（2.34±0.22），（1.26±0.31），差异有统计学意义（P<0.05）。结论：黄芩苷可提高复发性流产小鼠雌激素水平，降低母胎界面中炎性状态，与抑制子宫内膜巨噬细胞浸润，调控TLR4-核因子-κB信号通路活性有关。

关键词 黄芩苷;反复自然流产;活化Toll样受体4/核因子-κB信号通路;活化Toll样受体4/核因子κB信号通路

Effects of Baicalin on the Activation of Toll Like Receptor 4/NF-κ B Signaling Pathway in Mice with Recurrent Abortion

JIAO Wei，CUI Hongmei，HUO Yelin，WANG Jingya

（Department of Gynecology and Obstetrics， Baoding First Hospital， Baoding 071000， China）

Abstract Objective：To investigate the effects and mechanism of Baicalin on recurrent abortion mice.Methods：Construction of recurrent abortion mouse was based on Clark′s classic model， and the mice with recurrent abortion successfully constructed were randomly divided into a model group and a test group with 10 mouse in each group.Meanwhile， normal pregnant mice with 10 mouse were as control the group.On the second day of pregnancy， 0.4 mL/mg baicalin was given by gavage in the test group， and 0.9% NaCl was given by gavage in the model group and the control group once a day for 7 days.Enzyme linked immunosorbent assay were used to detect the levels of hormones in serum and content of inflammatory factors in maternal-fetal interface; immunohistochemistry was used to detect the distribution of macrophages in mouse uterus; Western blotting was used to detect the expression of activated toll like receptor 4 （TLR4）， nuclear factorκ B （NF-κB） and myeloid differentiation factor 88 （MyD88） protein expression in mouse uterus.Results：TNF-α/IL-4 were （2.78±0.36）， （4.89±0.58） and （3.39±0.34） in the control group， model group and test group， and E2 were （25.16±3.69）， （17.56±4.52） and （22.36±4.16） ng/L in the serum.The relative expressions of CD14 protein in the mouse uterus were （9.36±2.34）， （68.12±13.52） and （33.46±2.85）， respectively.The expressions of TLR4 protein expressions were （0.23±0.02）， （1.25±0.33） and （0.45±0.12）.NF-κB protein expressions were （0.59±0.14）， （1.52±0.36） and （0.78±0.25）， MyD88 protein expressions were （0.63±0.24）， （2.34±0.22） and （1.26±0.31）， all of which were statistically significant （P<0.05）.Conclusion：Baicalin can improve the estrogen level of mouse with recurrent abortion， reduce the inflammatory state of the maternal fetal interface.It is related to the inhibition of intimal macrophage infiltration and the regulation of TLR4-NFκB signaling pathway activity..

Keywords Baicalin; Recurrent spontaneous abortion; Activation of Toll like receptor 4/nuclear factor kB signaling pathway; Activation of Toll like receptor 4/nuclear factor κB signaling pathway

中图分类号：R284;R271.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.007

自然流产的临床发生率为15%～25%，反复自然流产多是指连续2次或2次以上发生的自然流产，临床发生率为0.4%～0.8%[1-2]。目前西医各种免疫治疗方案存在较多的风险，如感染、输血过敏反应、激发和加重自身免疫性疾病等[3]。母胎免疫耐受的形成机制复杂，其中子宫局部的免疫调节、免疫遗传等均参与其中;且研究发现，Th1/Th2失衡导致母胎界面局部的细胞因子紊乱，影响局部内环境的稳态，也影响了母胎免疫耐受[4]。黄芩是我国具有清热安胎作用的中药材，其中黄芩苷是主要的生物学成分之一，属于黄酮类物质[5]。本研究探讨黄芩苷对复发性流产小鼠的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/c小鼠，雌性CBA/J小鼠，雄性DBA/2，SPF级，8～10周龄;购于甘肃中医药大学，生产许可证号：SCXK（甘）2015-0002;于室温22～25 ℃，湿度50%～65%，12 h明暗交替环境下饲养约6 d，完全适应新环境后进行实验研究。

1.1.2 药物 黄芩苷（上海纯优生物科技有限公司，纯度：98%，批号：190811）。

1.1.3 试剂与仪器

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y20150608）;二步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：Z150413）;活化Toll样受体4（TLR4）（批号：AB150424）、核因子κB（NF-κB）（批号：AB150311）、髓样分化因子88（批号：MyD88）、抗体（批号：AB150523），以上购于英国Abcam公司;微量离心机（美国Thermo Fisher公司，型号：MICROCL17）;半自动切片机（德国Leica公司，型号：M2245型）;酶标仪（美国BIO-TEK公司，型号：Powerwave340）;电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：JYH27020）;生化培养箱（上海精宏实验有限公司，型号：SHP-150）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参照Clark经典模型[6]构建复发性流产小鼠（雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠按2∶1比例合笼交配），若检出阴栓或角化细胞中夹有大量精子则计为妊娠第0.5天，并将成功构建好的小鼠随机分为模型组和实验组，每组10只;同时建立正常妊娠小鼠模型10只（雌性CBA/J与雄性BALB/c小鼠按2∶1比例合笼交配）作为对照组。

1.2.2 给药方法 于妊娠第2天，实验组灌胃0.4 mL/mg黄芩苷，模型组和对照组注射等量0.9%氯化鈉注射液，1次/d，连续干预7 d。

1.2.3 检测指标与方法

酶联免疫吸附试验（ELISA）法[7]检测小鼠血清中激素水平：干预结束后，取各组小鼠眼眶静脉血，3 000 r/min离心15 min，ELISA法检测上清液中雌二醇（E2）、促卵泡成熟激素（FSH）、血清垂体泌乳素（PRL）水平。

ELISA法[8]检测小鼠母胎界面中炎性反应递质水平：干预结束后，处死小鼠，取小鼠一侧子宫组织，生理盐水清洗后制备成组织匀浆，10 000 r/min离心15 min，离心半径10 cm，ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-4（IL-4）水平。

免疫组织化学[9]检测小鼠子宫组织巨噬细胞分布情况：将小鼠子功组织石蜡切片经脱蜡、水化、3%过氧化氢封闭处理后，加分化抗原14（CD14）一抗（1∶100稀释），按照试剂盒操作步骤染色。于光学显微镜下判定染色结果，以Image J软件进行图像分析，每张照片中阳性染色面积的百分比代表CD14表达量。

蛋白免疫印迹法（WB）[10]检测各组小鼠子宫组织TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白表达情况：提取各组小鼠子宫胚泡着床部位组织，经液氮研磨后，常规提取组织蛋白，并进行定量，然后进行蛋白免疫印迹法检测，以β-actin为内参，经QWin图像分析软件统计TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以百分率表示，组间比较用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠母胎界面中TNF-α，IL-4炎性反应递质比较

与对照组比较，模型组血清TNF-α水平及TNF-α/IL-4升高，IL-4水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），且实验组小鼠母胎界面TNF-α水平及TNF-α/IL-4低于模型组，IL-4水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠血清中E2、FSH、PRL水平比较

模型组小鼠血清中E2，FSH，PRL水平均低于对照组和实验组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组小鼠子宫组织巨噬细胞分布情况

免疫组化染色可见，对照组、模型组和实验组小鼠子宫组织中CD14蛋白相对表达量分别为（9.36±2.34）%，（68.12±13.52）%，（33.46±2.85）%，其中模型组小鼠子宫组织中CD14蛋白均高于对照组和实验组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.4 各组小鼠子宫组织TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白表达比较

对照组、模型组和实验组小鼠子宫组织中TLR4蛋白表达量为（0.23±0.02），（1.25±0.33），（0.45±0.12），核因子-κB蛋白表达为（0.59±0.14），（1.52±0.36），（0.78±0.25），MyD88蛋白表达量为（0.63±0.24），（2.34±0.22），（1.26±0.31），其中模型组小鼠子宫组织中TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白均高于对照组和实验组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

3 讨论

黄芩及其有效成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等均显示出了对机体免疫功能的调节作用[11-12]。黄芩苷早期干预能够降低妊娠小鼠体内IFN-γ水平，提升IL-10水平，改善着床期小鼠子宫微环境，使子宫局部呈现Th2型反应;黄芩苷能通过调节母胎界面树突状细胞功能，降低复发性自发流产小鼠胚胎吸收率，诱导母胎免疫耐受[12-13]。研究发现，Th2型反应主要存在于正常妊娠时母胎界面中，表现为TNF-α、IFN-γ、IL-2等Th1型细胞分泌因子水平降低，以及IL-4、IL-6、IL-10等水平的升高[14]。TNF-α能阻遏Th2型细胞的分泌及胎盘滋养细胞的增殖;而IL-4是维系妊娠免疫耐受的关键因子，若小鼠体内缺乏IL-4，则无Th2型反应，其流产率及胚胎吸收率也骤然上升[15-16]。

本研究结果显示，经黄芩苷干预后实验组小鼠母胎界面TNF-α水平及TNF-α/IL-4低于模型组，IL-4水平高于模型组。提示黄芩苷可纠正Th1/Th2失衡现象，上调母胎微环境中的Th2型细胞因子水平，使其偏向Th2型，阻碍流产的发生。同时本研究还显示，黄芩苷可有效提高流产小鼠机体E2、FSH、PRL水平，改善性腺轴内分泌调节功能。巨噬细胞的变化是导致小鼠流产的关键，另外其可产生TNF-α，本研究用CD14标记子宫巨噬细胞，结果显示，实验组小鼠子宫组织中巨噬细胞数量明显低于模型组。研究显示，TLR4-核因子-κB信号转导通路可激活巨噬细胞并诱导流产的发生[17-18]。本研究结果显示，实验组小鼠子宫组织中TLR4、核因子-κB、MyD88蛋白表达量均较模型组降低，正常妊娠状态下TLR4/核因子-κB信号可能处于警备状态，当母胎界面受到刺激后可迅速激活，启动免疫保护[19]。该结果也进一步提示黄芩苷可能是通过调控TLR4-核因子-κB信号通路对复发性流产小鼠发挥治疗作用的。

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（2020-02-05收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目（20150150）作者简介：焦伟（1982.05—），女，硕士，主治医师，研究方向：妇科疾病，E-mail：18461212@qq.com