固相萃取小柱-超高效液相串联质谱测定牛奶中氯霉素

马晓年，梁志坚，李怡

（昆明市疾病预防控制中心,昆明650228）

0 引 言

牛奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质。2008 年1 月15 日，卫生部发布的《中国居民膳食指南(2007)》介绍了新版《膳食宝塔》凸显牛奶价值，牛奶是摄取营养元素的催化剂以及健康的关键，是健康膳食的基石[1]。但由于奶牛饲养过程中，对泌乳期奶牛用药不当、违反国家规定把抗生素作为奶牛饲料添加剂使用、未经彻底清洗和消毒患病奶牛使用过的挤奶工具及贮奶设备、高温季节掺杂抗生素防止牛奶酸败等原因，造成牛奶抗生素污染[2-3]。牛奶中的抗生素残留主要以氯霉素为主，氯霉素(Chloram⁃phnicol，CAP)属广谱抗生素，能抑制细菌蛋白质的形成，广泛用于动物各种传染性疾病的治疗，特别是用于奶牛乳腺炎的治疗，从而易使奶及奶制品中存在氯霉素残留。由于氯霉素可引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病[4]，1999 年9 月13 日中华人民共和国农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》[5]的通知，规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织不得检出。

目前，氯霉素主要通过固相萃取小柱进行前处理的提取、净化[6-7]，测定方法有液相色谱[8]、液相色谱-串联质谱[9-15]。液相色谱采用保留时间定性，易出现假阳性，而液相色谱-串联质谱采用核质比定性，具有更高的准确度。液相色谱-串联质谱较于液相色谱具有更高的灵敏度，实现对痕量物质更低的检出限。前处理部分，国标方法[11]采用C18 固相萃取小柱对牛奶进行提取、净化，风险监测工作手册[12]采用MSC 固相萃取小柱提取、净化鸡蛋等高蛋白样品。依据上述信息，本实验对比了C18、MSC 两种固相萃取小柱对牛奶样品中氯霉素的提取效果，为牛奶中氯霉素的测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

QTRAP 4500 质谱分析仪（美国AB SCIEX）；Ag⁃ilent 1290 高效液相色谱仪（美国安捷伦）；高速冷冻离心机（湖南赫西仪器）；振荡器（常州金坛恒丰仪器制造有限公司）；旋转蒸发仪（德国IKA）；氮吹仪（Reeko Auto EVA-30）；电子天平（Sartorius,0.01 mg）；均质器；Agela Technologies Cleanert MCS-SPE固相萃取小柱（500 mg/6 mL）；Agela Technologies Cleanert S C18-SPE固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。

液态牛奶，市购；氯霉素（坛墨质检-国家标准物质中心）；氯霉素-D5（坛墨质检-国家标准物质中心）；甲醇、乙酸乙酯（色谱纯，美国JT Baker）；氨水、氯化钠（分析纯）；正己烷（优级纯）；实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

准确量取氯霉素标准溶液25 μL，用甲醇稀释并定容至100 mL，得到25.00 ng/mL 的氯霉素应用液。准确量取氯霉素-D5 标准溶液20 μL，用甲醇稀释并定容至100 mL，得到20.00 ng/mL 的氯霉素-D5 应用液。标准应用液均于4 ℃条件下保存。

1.2.2 样品的提取

取10 g（精确至0.01g）均质好的牛奶样品于50 mL离心管中，加氯霉素-D5 标准应用液100 μL，再加乙酸乙酯20 mL，振荡15 min，5 000 r/min 离心10 min，取乙酸乙酯层于鸡心瓶中。再加20 mL 乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，于40 ℃水浴旋转蒸发至干。用5 mL 4%氯化钠溶液溶解残留物，加5 mL 正己烷振荡混合1 min，静置分层，弃去正己烷。再加正己烷5 mL，重复提取一次，取下层液备用。

1.2.3 样品的净化

C18及MCS小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，取备用液分别过C18 及MCS 固相萃取小柱，用5 mL水淋洗抽干，再用5 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于40 ℃下氮气吹干。用1.0 mL甲醇溶解残留物，涡旋混匀，过0.22 μm 滤膜，供超高效液相-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定。

1.2.4 仪器条件

色谱：Syncronis C18 色谱柱（100×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A：0.05%氨水，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序件（见表1）；流速：0.40 mL/min，分析时间5 min，进样体积5 μL，柱温30 ℃。

表1 流动相梯度洗脱

质谱：离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；电离电压：4.0 kV；检测方式：多反应检测（MRM）；离子源温度：500 ℃；喷雾器压力：50 psi；辅助加热气：50 psi；气帘气压力：35 psi；其他参数见表2。

表2 各化合物质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

根据待测物的性质，使用氯霉素及氯霉素-D5 标准应用液在ESI-模式下分别进行质谱条件优化。选择每种药物响应强度最高的m/z 值作为母离子，进行子离子扫描，并优化去簇电压和碰撞电压。并在MRM 模式下优化了气帘气、离子源温度、喷雾气、辅助加热气。

2.2 色谱条件优化

本文实验了Hypersll GOLD色谱柱（100×2.1 mm，1.9 μm），Syncronis C18 色谱柱（100×2.1 mm，1.7 μm），发现采用Hypersll GOLD 色谱柱（100×2.1 mm，1.9 μm）分离时，色谱峰展宽，响应值偏低。采用Syncronis C18色谱柱（100×2.1 mm，1.7 μm）分离时，色谱峰得到较大改善，峰形收窄，响应增高，基线噪音降低，实现更低检出限。

本文选择流动相时考虑到是ESI-模式，所以使用了0.05%氨水及具有改善峰形作用的乙腈。低流速时，峰形展宽、拖尾，综合分离效果及柱压等因素，最终选择0.4 mL/min 流速。图1 为1.00 ng/mL 的氯霉素标准溶液MRM 谱图。

图1 CPA标准MRM谱图

2.3 样品前处理方法的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

本文试验了乙腈-乙酸乙酯（10：90）、乙腈-乙酸乙酯（20：80）、乙腈-乙酸乙酯（50：50）及乙酸乙酯的提取效果。乙腈-乙酸乙酯（10：90）、乙腈-乙酸乙酯（20：80）分层效果不理想，震摇乳化。乙腈-乙酸乙酯（50：50）提取，分层效果较好（分为乙腈层、磷脂层、乙酸乙酯层），但加标回收率较低，在21.6%～48.5%之间。乙酸乙酯，振荡提取效果较好，回收率均能达50%以上。

图2 不同提取溶剂对比

2.3.2 提取方法的选择

本文比较了《2019 年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》[11]中用乙酸乙酯提取一次，氮气吹干水溶解过固相萃取小柱提取、净化，及GB 29688-2013《牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》[12]中乙酸乙酯提取两次，旋转蒸发至干，水溶液溶解过固相萃取小柱提取、净化。实验发现，手册的提取方法损失较大，回收率均于60%以下，国标方法提取效果较佳。

2.3.3 固相萃取柱的选择

本文进行了0.10、0.50、2.50、10.00 ng 4 个水平的加标回收实验，比较了C18 及MCS 两种固相萃取小柱对氯霉素的保留能力。结果表明MCS 固相萃取小柱4 个水平的回收均实现75%以上，而C18 固相萃取小柱在低水平回收实验中效果不佳，回收率低于50%。实验结果见表3。

表3 两种固相萃取柱的回收率（%）

2.4 标准曲线及检出限

用甲醇将氯霉素-D5 及氯霉素标准应用液制备成含氯霉素-D5 2.00 ng/mL，含氯霉素分别为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 ng/mL 的标准工作溶液，在确定的分析条件下进行测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，氯霉素与氯霉素-D5 响应值之比为纵坐标绘制标准曲线，得到的线性方程、相关系数及检出限见表4。

表4 氯霉素的线性方程、相关系数、检出限

2.5 精密度及准确度

图3 工作曲线

取不含氯霉素的牛奶样品分别过C18 及MCS 固相萃取小柱进行三水平加标回收率实验，结果见表5。由表中可见，C18 固相萃取小柱回收率在31.4%～155%之间，在低水平及高水平的回收率均不理想，而MCS 固相萃取小柱在三个水平的加标回收率均能达到50.4%以上。结合上述固相萃取小柱回收试验，说明MCS 固相萃取小柱有更良好的准确性，适宜于牛奶中氯霉素残留的痕量测定。图4 为牛奶样品添加氯霉素的MRM 谱图。

表5 氯霉素在不同加标水平下的加标回收率及相对标准偏差（n=3）

图4 加标样品MRM谱图

3 结 论

本研究采用2 种不同的固相萃取小柱对牛奶中的氯霉素进行提取、富集和净化，通过对回收率、精密度、定量限等指标进行考察，得出MCS 固相萃取小柱损失小，回收率高，同时检出限可达到0.004 μg/kg，远低于国标方法，且稳定性高，适用于大量样品的集中测定。

建立了UPLC-MS/MS 内标法测定牛奶中氯霉素含量的方法。分析过程中引入氯霉素-D5 作为内标物，对于分析全过程中导致目标物损失给予完全的校正，改善了方法的精密度。以Syncronis C18 色谱柱分离，流动相为0.05%氨水和乙腈，电喷雾负离子MRM 模式检测。该法测定周期短、定性、定量准确，适用于痕量氯霉素的检测。