添加糖蜜对油莎草青贮发酵品质及黄酮的影响

靳思玉，王立超，李苗苗，张嘉宾，王健，张爱忠，曹阳,3

（1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆，163000；2.黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，黑龙江 大庆，163000；3.畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室，哈尔滨150030）

0 引 言

油莎草（Cyperusesculentus L）为莎草科多年生草本植物，原产于地中海，于上个世纪五十年代引入我国[1]。油莎草耐旱耐涝，对土质要求不高，除蝗虫以外无其他病虫害。分蘖速度快，产量高且稳定。地下块茎部分油脂含量高，做榨油使用。茎叶的油脂含量低，不作为深加工的原料，一般制成干草直接饲喂家畜，或是弃于田间直接焚烧，不仅破坏环境还造成资源浪费[2]。目前畜牧业上对油莎草的认知度并不够，尤其缺乏对油莎草作为饲料贮藏加工方面的研究。

《名医别录》中记载油莎草茎叶具有行气止痛、疏肝解郁、主胸闷不舒、风疹瘙痒和痈伴随肿毒等功效。研究表明黄酮是油莎草茎叶部分主要活性物质，其主要功能就是抗炎消毒、抗肿瘤和清除自由基等作用[3]。如果可以在畜牧行业加以利用，不仅在一定程度上可以代替抗生素，还具有保护动物健康的作用。研究表明，青绿牧草在加工干草的过程中，黄酮等功能性成分提取量较低[4]。青贮加工不仅可以保持牧草青绿多汁的特性，减少牧草中营养物质损失，还可以最大程度保留牧草中生物活性物质[5]。而温度对青贮发酵品质有着重要影响，低温环境会降低青贮发酵过程中乳酸菌等有益菌的活性，抑制其生长，从而降低发酵品质[6]。低温影响着高寒地区低温季节对青贮饲料的利用，目前低温青贮饲料技术的研究报道并不多，在低温条件下提高青贮发酵品质，降低发酵腐败几率，可以促进高寒地区对青绿饲料资源开发与利用，对缓解高寒地区在低温季节饲料短缺问题具有重要意义。

糖蜜是制糖工业的副产品，含有许多糖类物质和营养成分[7]。Cao[8]等在添加糖蜜对全麦全混合日粮青贮饲料发酵品质及体外干物质消失率影响的研究中发现，添加糖蜜可以提高青贮发酵品质和体外干物质消失率。本研究通过分析在不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮的一般化学成分、黄酮含量、发酵品质、微生物组成以及体外消化影响，探索油莎草青贮饲料在不同温度下调制加工技术，为其作为草食动物饲料资源提供数据参考以及和理论依据。

1 材 料

1.1 油莎草及添加剂

油莎草采自大庆市杜尔伯特草原，于通风处晾至半干（含水量65%左右），切短至2-3 cm。糖蜜购自成都金糖蜜商贸有限公司，总糖（蔗糖+还原糖）≥40%，°Bé≥33.333。

1.2 培养基制备

配制MRS 琼脂培养基（De Man，Rogosa and Sharpe Agar，MRS，培养乳酸菌）、蓝色琼脂培养基（Blue Light Broth Agar，BLB，培养大肠杆菌）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Aextrose Agar，PDA，培养酵母菌和霉菌）、营养琼脂培养基（Nutrient Agar，NA，培养好氧菌和耐热菌）、梭菌计数琼脂培养基（Clos⁃tridial Count Agar，CCA，培养丁酸菌）培养基备用。配制好的培养基需要用灭菌锅灭菌（121 ℃，20 min），每个培养皿倒入20 mL 左右。培养板凝固后放入37 ℃恒温培养箱中，12 h 后查看是否有污染，若有污染弃用。

1.3 主要仪器

真空包装机（AT-620），北京吉奥德包装机械有限公司；压力蒸汽灭菌锅（GR85DF），厦门致微仪器有限公司；生物洁净工作台（BCN-1360B），北京东联哈尔仪器制造有限公司；pH 值计（FE20-K），梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司；高速冷冻离心机（1-14K），上海珂淮仪器有限公司；高效气象色谱仪（GC-2010），岛津企业管理（中国）有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9070B），电热恒温水浴槽（DK-80），电热恒温培养箱（DRP-9082），均购自上海森信实验仪器有限公司；微型植物粉碎机（FZ-102），山西太原腾达科学器材有限公司；电子天平（JD100-3B），沈阳龙腾电子有限公司；超纯水机（XYE2-2--H）北京湘顺源科技有限公司；厌氧培养箱（YQX-Ⅱ），上海新苗医疗器械制造有限公司；均质器（BAGMIXER®400W），上海巴玖实业有限公司；空气浴振荡器（HZQ-C），哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；紫外可见分光光度计（UV-6100A），上海元析仪器有限公司；茂福炉（SRJX-8-13A），广州航信科学仪器有限公司；凯氏定氮仪（K9840），广州市科迅实验器材有限公司；半自动纤维仪（A200i），合肥艾本森科学仪器有限公司。

2 方 法

2.1 试验设计

试验采用两因素的试验设计（添加2×温度2），采用小规模青贮调制法，置于常温（22±2 ℃）和低温（4 ℃）下发酵35 d。试验分为2 个处理组（每个处理三个重复），包括对照组（无添加）、糖蜜组（添加量4%，鲜物质基础）。称取处理好的样品200 g 装入规格为16×25 cm 聚乙烯袋中，真空密封包装后放置常温和4 ℃冰箱中保存。

2.2 感官品质评定

根据青贮质量评定标准的说明[9]，油莎草青贮开封后对其颜色、气味、质地以及有无霉变这四个方面进行品质评定。

2.3 一般化学成分分析

将开封后的样品放入电热恒温鼓风干燥箱中，在65 ℃条件下烘至恒重，由此得出自由水含量。用微型植物粉碎机将样品粉碎并过1 mm 筛后进行一般化学成分分析，测定项目包括干物质、有机物、粗脂肪、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维含量。

有机物、粗蛋白、粗脂肪的测定分别用（AOAC）中的方法934.01、976.05、920.39 进行[10]中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维利用Van soest方法进行测定[11]。

2.4 黄酮含量测定

根据杨文菊、敬思群、杨洁[12]方法进行标准曲线建立和黄酮含量测定。

2.5 发酵品质测定

称取开封后的原样20 g 置于聚乙烯袋中，加入180 mL 灭菌蒸馏水，用均质器拍打90 s，用快速定性滤纸过滤测定pH 值。一部分滤液经12 000 r/min 离心5 min，并用0.22 μm 滤膜过滤后，采用气相色谱仪进行乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分析。

色谱条件为：汽化室参数为载气氮气（N2），分流比40∶1，进样量0.4 μL，温度220 ℃；色谱柱参数为HP-IN⁃NOWax毛细管色谱柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均线速度38 cm/s；柱温箱参数为程序升温120 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min 上升至180 ℃保持1 min；检测器参数为氢气（H2）流量40 mL/min，空气流量450 mL/min，柱流量+尾吹气流量45 mL/min，火焰离子检测器（FID）温度250 ℃

根据冯宗慈、高民[13]的方法测定氨态氮。

2.6 微生物组成

将MRS、BLB、NA、PDA 培养基划定1×10-1倍、1×10-3倍、1×10-5倍3个培养区域，其中CCA 和NA（耐热）培养基划定1×10-1倍和1×10-2倍2 个培养区域。用无菌水将聚乙烯袋内剩余的菌液进行梯度稀释，连续稀释为1×10-1、1×102、1×103、1×10-4及1×10-5倍液。用移液枪移取20 μL，按照培养基中预先划分好的区域将稀释液以先高倍后低倍的顺序滴入培养基中，并用涂菌棒均匀涂开。将101和102稀释液水浴加热（75 ℃，15 min），快速冷却后涂CCA、NA（耐热）培养基。其中MRS、CCA 置于厌氧培养箱（37 ℃）培养，其余置于恒温培养箱（37 ℃）培养48 h 后取出进行菌落数计数。

2.7 体外消化

使用两头安装永久性瘤胃瘘管的雄性大尾寒羊，体重为37±5 kg（黑龙江八一农垦大学动物饲养实验室），在早晨饲喂后2 h 从瘤胃瘘管抽取瘤胃液（所使用的所有工具必须提前预热至39 ℃），用纱布过滤，通入CO2保持厌氧环境，并以人工唾液：瘤胃夜为4∶1比例均匀混合。人工唾液按照Mc Dougll’s buffer 方法[14]（每1 000 mL 含有氯化钾0.57 g、碳酸氢钠9.80 g、氯化钙0.04 g、十二水磷酸氢二钠9.30 g、氯化镁0.06 g、氯化钠0.47 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.25 g、刃天青钠盐0.01 g 配制。用天平准确称取开封后粉碎的青贮0.50 g（干物质基础）提前装入容量为125 mL 的血清瓶，注入50 mL 混合培养液，迅速封好瓶口，置于39 ℃，100 r/min 的空气浴振荡器，培养48 h。培养结束后将血清瓶放入冰水中停止发酵，这时开始进行pH 值、干物质消失率、产气量进行测定。

经快速定性滤纸过滤后的培养液10 mL 移到离心试管，经高速冷冻离心机2 200 r/min 离心5 min，上清液移出备用。取出上清液1 mL，加等量的10%偏磷酸溶液（偏磷酸溶解于1 mol/L 硫酸溶液，10%w/v），充分混合（除蛋白）。再经高速冷冻离心机6 000 r/min 离心30 min，得上清液。上清液取0.5 mL，加入标准品20 mmol/L 的丁烯酸0.5 mL 充分混合。混合液的丁烯酸浓度为10 mmol/L（与标准液浓度相同）。再将混合液中加入纯磷酸0.01 mL 充分混合（调整为酸性），将混合后的溶液4 ℃放置一个晚上。放置后的液体，经高速冷冻离心机6 000 r/min 离心30 min，取上清液，再用0.45 μm 微孔滤膜过滤后，用高效气相色谱仪分析乙酸、丙酸、丁酸含量（色谱条件同上）。

2.8 统计分析

本实验使用SAS 9.2 统计学软件，对差异显著项目进行多重比较，并采用Tukey 检验用于比较平均数之间的差异显著性（P＜0.05）。

3 试验结果

3.1 感官品质

结果见表1。由表1 可知，在常温条件下，青贮后的油莎草均为黄绿色，糖蜜组的酸香味浓于对照组，质地柔软且水分适宜，无霉变；在低温条件下，糖蜜组比对照组黄，且酸香味浓于对照组，质地柔软且水分适宜，无霉变。

表1 不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮感官品质的影响

表2 不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮一般化学成分的影响

3.2 化学成分分析

结果如表2 所示，在添加处理组中，干物质、有机物和酸性洗涤纤维含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），粗蛋白、粗脂肪和中性洗涤纤维含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）；在温度处理组中，干物质、粗脂肪、有机物和酸性洗涤纤维含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），粗蛋白和中性洗涤纤维含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）；在添加和温度处理交互作用下，干物质、有机物和酸性洗涤纤维含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），粗蛋白、粗脂肪和中性洗涤纤维含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

3.3 黄酮含量

结果如表3 所示，在添加处理组、温度处理组、添加和温度处理交互作用下黄酮含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

3.4 发酵品质

结果如表4 所示，在添加处理组中，pH 值、乳酸和氨态氮/总氮与对照组相比差异显著（P＜0.05），乙酸、丙酸和丁酸含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；在温度处理组中，pH 值和氨态氮/总氮与对照组相比差异显著（P＜0.05），乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；在添加和温度处理交互作用下，pH 值、乳酸和氨态氮/总氮与对照组相比差异显著（P＜0.05），乙酸、丙酸和丁酸含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮黄酮含量的影响

3.5 微生物组成

结果如表5 所示，在添加处理组中，乳酸菌、耐热菌、一般细菌和酵母菌数量与对照组相比差异显著（P＜0.05）；在温度处理组中，乳酸菌、一般细菌和酵母菌数量与对照组相比差异显著（P＜0.05），耐热菌数量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；在添加和温度处理交互作用下，乳酸菌、耐热菌、一般细菌和酵母菌数量与对照组相比差异显著（P＜0.05）；各处理组中均未检出大肠杆菌、丁酸菌和霉菌。

3.6 干物质消失率和挥发性脂肪酸

结果如表6 所示，在添加处理组中，干物质消失率、pH 值、乙酸、丙酸和氨态氮含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），产气量和丁酸含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）；在温度处理组中，干物质消失率、pH 值、产气量、乙酸、丙酸、和丁酸含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），氨态氮含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）；在添加和温度处理交互作用下，干物质消失率、pH 值、乙酸、丙酸和氨态氮含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），产气量和丁酸含量与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

4 讨 论

经过发酵处理后的饲料质地柔软，水分适宜，并且有浓厚酸味[15]。经过35 d 的青贮后，油莎草青贮均未发现霉变，主要呈现为黄绿色，质地柔软，不粘手，水分适宜，这与刘辉[16]等研究结果相同。在低温条件下发酵的对照组还呈草绿色，具有草香味，说明低温对照组在发酵35 d 时还未进入发酵稳定期，在低温条件下青贮发酵速度远远低于常温条件[17]。

表4 不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮发酵品质的影响

表5 不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮微生物的影响

表6 不同温度下添加糖蜜对油莎草青贮干物质消失率及挥发性脂肪酸的影响

青贮饲料中粗蛋白被降解成氨态氮，降低有机物含量，造成一些营养损失[18]，这与本研究结果一致。青贮饲料中的氨态氮/总氮反应了青贮过程中粗蛋白的分解程度，氨态氮/总氮愈大时，表明粗蛋白分解越多，青贮饲料的发酵品质越低[18]。在本实验中，糖蜜组氨态氮/总氮显著低于对照组（P＜0.05），粗蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05），说明添加糖蜜降低蛋白质水解程度。在青贮发酵的0～7 d 蛋白水解酶活性比较强，蛋白快速被水解，但在发酵后期蛋白水解酶活性逐渐下降蛋白分解缓慢[20]。研究表明，蛋白水解酶的最适pH 值为6.8～9.8[21]。而在整个青贮发酵过程中由于乳酸含量在发酵前期快速上升，导致pH 值快速下降，而在发酵后期乳酸含量和pH 值变化趋于缓和。在本实验中，糖蜜组的乳酸含量显著高于对照组（P＜0.05），pH 值显著低于对照组（P＜0.05）。由此我们推测pH 值的下降抑制了蛋白水解酶活性，导致糖蜜组氨态氮/总氮显著低于对照组（P＜0.05），粗蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05），说明添加糖蜜降低蛋白质水解程度。Alli 等人评价了添加糖蜜对全株银合欢青贮的影响，糖蜜以2.25%和4.5%的鲜物基础进行添加，结果表明，添加组乳酸含量高于对照组，pH 值降低，减少干物质损失，氨态氮/总氮也低于对照组，这与本研究的结果一致。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量降低。这与顾拥建等[22]的研究结果相同。在低温的条件下，糖蜜组的粗蛋白、粗脂肪含量略高于对照组，有机物、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维略低于对照组，这与刘秦华等[23]研究相同。糖蜜组的营养成分高于对照组，说明在低温条件下添加糖蜜对营养成分的保存有一定的作用。

黄酮类化合物与植物细胞壁中的木质素结合在一起，青贮过程可以破坏植物细胞壁，使得更多的黄酮被释放出来[24]。王洋[5]等在乳酸菌添加剂对苜蓿青贮黄酮含量影响的研究中发现，处理组黄酮含量显著高于对照组（P＜0.05）。而发酵品质优良的青贮酸性洗涤纤维含量低于对照组，在本研究中，在常温和低温条件下糖蜜组黄酮提取量高于对照组。

乳酸含量高是发酵品质良好的典型特征[25]，在青贮饲料发酵过程中，乳酸菌可以有效利用可溶性碳水化合物产生乳酸，以降低pH 值，抑制有害微生物的生长繁殖，从而获得品质良好的青贮饲料[26]。而青贮中添加糖蜜会为乳酸的生成，提供更多的发酵底物[8]。在本试验中，在不同温度条件下糖蜜组pH 值显著低于对照组（P＜0.05），常温条件下糖蜜组乳酸含量显著高于对照组（P＜0.05），低温条件下乳酸含量虽然与对照组差异不显著，但高于对照组59.02%。

乳酸菌在青贮发酵中起重要作用，乳酸菌数量已成为预测青贮饲料发酵充分性的重要因素，通常，乳酸菌数量达到105（cfu/g FM）时，青贮饲料可以很好的保存[27]，在本实验中，各处理组的乳酸菌数量均高于105（cfu/g FM），说明油莎草青贮发酵非常充分且保存完好。发酵是在厌氧环境下进行，随着发酵过程中乳酸菌数量增加，使得其乳酸含量增加，随着pH 值的降低，抑制有害微生物的生长和繁殖[28]。在本试验中，常温条件下乳酸菌数量显著高于对照组（P＜0.05），耐热菌、一般细菌和酵母菌显著低于对照组（P＜0.05），这与Cao 等[29]研究结果相同。低温会抑制微生物的生长，所以微生物数量都低于常温，这与王鹏等[30]研究结果相同。在低温条件下，糖蜜组的乳酸菌数量高于对照组12.85%，耐热菌、一般细菌和酵母菌分别低于对照组8.38%、10.89%和12.89%。

瘤胃内的pH 值是衡量瘤胃微生物生态系统平衡的重要指标，也是建立平衡微生物种群的一个限制性因素[31]。瘤胃内pH 值与发酵产生的气体成反比[32]，瘤胃内氨态氮是瘤胃微生物蛋白质合成的重要氮源[33]，瘤胃微生物蛋白和挥发性脂肪酸为反刍动物提供了大量的蛋白质和能量，此外，饲料中的多糖是瘤胃微生物的重要能量和碳源[34]。Yahaya 等[35]研究表明，随着饲料的青贮时间延长纤维的消化率增加，提高青贮饲料的干物质消失率。在本试验中，糖蜜组的干物质消失率显著提高（P＜0.05），产气量、乙酸、丙酸和丁酸高于对照组，这与Cao 等[36]人的研究结果一致。在瘤胃中丙酸和甲烷的产生都需要氢气，因此，丙酸的形成可以被视为氢气使用的竞争途径[37]，当乳酸利用细菌在瘤胃中二次发酵时，通常会产生丙酸盐[38]，这可以减少甲烷的产生。本研究结果显示糖蜜组的丙酸含量高于对照组，说明添加糖蜜在一定程度上可以减少甲烷的产生。

5 结 论

在本试验条件下添加糖蜜可以提高常温和低温条件下油莎草青贮的发酵品质和黄酮含量。