丝状真菌在发酵豆粕中的应用研究概述

彭 俊，励 飞，刘 维

（湖南九鼎动物营养研究院有限公司，长沙 410007）

近年来，随着养殖、饲料加工等行业的发展，饲料资源短缺的问题日益加剧，而豆粕具有营养全面、粗蛋白含量高、氨基酸组成均衡等优点，被广泛用于饲料生产中。因此，如何去除豆粕中抗营养因子、提高小肽及其在畜禽中消化率、畜禽肠道健康等是近年来的研究热点课题。国内外大量研究表明，微生物发酵豆粕是一种多功能的优质蛋白质原料，而丝状真菌在发酵豆粕中的研究应用也有部分的研究报道。丝状真菌以其代谢产复杂酶系、少量有机酸、生物健康因子等优势在豆粕发酵处理中有巨大潜力。本文就丝状真菌在发酵豆粕中的应用现状进行概述，以期为丝状真菌在发酵豆粕中研究应用提供参考。

1 发酵豆粕研究现状

1.1 豆粕原料特点

豆粕是大豆被榨油后的副产物，其营养全面且丰富，粗蛋白质含量高达50%，含有多种必需氨基酸，特别是其他植源性原料所缺乏的赖氨酸含量高达2.5%～3.0%[1]。基于目前饲料行业中动物蛋白鱼粉、骨粉的价格高昂及其资源的有限性，豆粕成为了有效的替代品，也是目前饲料工业中应用最为广泛的植物性蛋白质原料。但是把豆粕直接作为动物饲料的原料，会由于豆粕中的营养物质很大程度上得不到充分的利用和吸收，这直接浪费了大量的营养资源，降低了饲料的利用率，同时豆粕中抗营养因子也给动物的生长繁殖带来了众多不利的影响[2]。

1.2 豆粕中的抗营养因子

饲料中一类影响其营养成分的消化吸收以及可以使动物产生不适反应的物质称为抗营养因子。目前在豆粕中已经发现了10 多类抗营养因子，根据对温度的敏感程度可以分为热敏性抗营养因子（对温度较为敏感，在高温下容易变性）和热稳定性抗营养因子（在高温下保持稳定存在）两类。热敏性抗营养因子主要有胰蛋白酶抑制剂、脲酶和大豆凝集素等，热稳定性营养因子主要包括大豆抗原蛋白、植酸和寡糖（水苏糖和棉籽糖）等[3-4]。大豆抗营养因子特点及特性见附表[5-10]。

附表 大豆抗营养因子类别及特点

1.3 豆粕处理方式及发酵豆粕特点

早期对豆粕的处理方式主要有两种：通过物理高温处理豆粕，酶水解豆粕。化学法处理豆粕药剂残留毒素对动物健康影响太大，极少应用。高温加工豆粕缺点是豆粕中大量蛋白在高温下变性、溶解度降低，同时使豆粕的营养价值大打折扣，豆粕中氨基酸结构发生改变或者被破坏，这也使得动物对蛋白的消化吸收率严重降低[11]。同样酶解豆粕使得成本变得高昂、耗水量大、能耗高等缺点[12]。目前，微生物固态发酵豆粕是当前处理豆粕的研究热点，以豆粕为主要原料，利用固态发酵技术接种单一或者复合微生物发酵菌剂，控制一定的发酵条件（水分、湿度、温度等）处理豆粕。其优势是成本低、安全和环保，可降低抗营养因子的抑制作用，提高蛋白质的消化利用率，生物活性因子高，含有一定益生菌，有益动物肠道健康[13-14]。

2 丝状真菌在发酵豆粕中应用现状

2.1 丝状真菌在发酵豆粕中应用菌株及特点

丝状真菌是指丝状，无光合作用的异氧型真核微生物，菌丝球是丝状真菌培养过程中形成的松散且不规则、致密或光滑的球形、近球形微生物颗粒，其内部结构各不相同，菌丝球按形态可分为松散型、紧密型和空心菌丝球，目前菌丝球的形成机理已有大量研究[15-18]。丝状真菌在工业发酵和科研方面应用非常广泛，常用作发酵菌株的有米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、白地霉（Geotrichum candidum）、白腐真菌、木霉（Trichoderma spp.）、土曲霉（Aspergillus terreus）、毛霉（mucor）、红曲霉（Monascus purpureus Went）等[19]。丝状真菌在很多食品、饲料原料的发酵处理中发挥着重要作用，能产生复杂的酶系如：糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等酶系，对降解发酵原料和原料呈香呈味物质具有重大贡献[20-22]。目前豆粕发酵菌种一般采用芽孢杆菌和乳酸菌等较易控制的细菌等发酵，其中丝状真菌在豆粕发酵中的研究较少，主要有黑曲霉、米曲霉、木霉、米根霉（Rhizopus oryzae Went et Pr.Geerl.）、产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）等，其中被市场接受且在豆粕中发酵最广泛的是黑曲霉和米曲霉两种丝状真菌[23]。

2.1.1 黑曲霉及其在发酵豆粕中的应用

黑曲霉属于真核生物子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科，是一种常见的曲霉属真菌，广泛分布在谷物、空气、土壤等环境中，黑曲霉是公认安全的微生物[24]。且黑曲霉的萌发生长速度较快，产酶周期较短，用黑曲霉发酵生产酶的种类丰富、安全性高且不会代谢产生毒素[25-27]。据统计调查，许多主要商品酶制剂都来源于黑曲霉，分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、果胶酶、柚苷酶、蛋白酶和单宁酶，在工业酶制剂生产中具有重要作用[28]。因此，黑曲霉在豆粕中应用可以降解豆粕中非淀粉多糖、蛋白质、细胞壁等，进而提高豆粕消化吸收率，此外黑曲霉还能代谢产生多种有机酸、维生素和未知生长因子从而提高豆粕的营养价值。吴宝昌等利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合发酵豆粕，优化发酵条件后可将豆粕中肽的转化率提高至40.8%[29]。杨文宇等利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合发酵作为前发酵，再接种酿酒酵母和保加利亚乳杆菌作为后发酵，能将大豆肽转化率提高至65.8%[30]。郑环宇等筛选最优豆粕菌种黑曲霉、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母接种比例为2∶1∶1∶2，进行固态高温发酵，结果表明豆粕中粗蛋白质含量增加24.36%，且豆粕中氨基酸提高了约7%，胰蛋白酶抑制剂基本被清除，抗原蛋白大部分被降解[31]。朱平军等以黑曲霉为菌种接种豆粕发酵，采用单因素试验结果显示最优发酵条件为发酵72 h、温度28 ℃、接种量为4%、料水比1∶0.9，黑曲霉发酵豆粕使酸溶蛋白酶含量由1.75%增加至13.62%，这是因为黑曲霉在发酵过程中产生酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等消化酶对助于豆粕分解消化，且黑曲霉分泌酸性蛋白酶主要是端肽酶，其功能是从大豆蛋白肽链的末端开始水解，特异性酶切使大分子蛋白质被分解为小豆肽[32-33]。

2.1.2 米曲霉及其在发酵豆粕中应用

米曲霉是半知菌亚口，丝抱纲，丝抱目，从梗抱科，同黑曲霉一样是曲霉属真菌中的一个常见种，分布甚广，主要分布在粮食、腐败有机物和土壤等环境中，是我国传统酿造酱油、酒类及制作豆酱的重要菌种，具有良好的蛋白分泌能力，被美国食品药品监督管理局认定为食品安全菌株（GRAS）[34-35]。米曲霉在发酵中也同黑曲霉一样能分泌复杂的酶系，分解糖类和蛋白质等大分子物质，其也应用于多种重组酶和天然酶的工业化生产，如以淀粉物质原料为基质诱导分泌系列淀粉酶，利用马铃薯粉渣生产酸性蛋白酶，利用麸皮生产中性蛋白酶等，此外米曲霉还可分泌羧肽酶、木聚糖酶、植酸酶、脂肪酶类、纤维素酶、柚苷酶等。米曲霉和黑曲霉的生长产酶温度也存在差异，黑曲霉在28 ℃生长产酶较佳，且以糖化酶和液化酶为主，米曲霉较佳的生长产酶温度较高为35 ℃，其产蛋白酶较高[36-39]。相比于黑曲霉，Cristiane等研究表明，米曲霉具有较强的蛋白质合成及分泌能力以及强大的翻译后修饰能力，且米曲霉基因序列中特异性序列上有大量的与次级代谢产物合成和转运相关的基因，这也为后续较多研究者有针对性的在米曲霉基因中进行改造以获得其目的酶的高效表达[40]。孙立斌等利用通过紫外诱变和遗传稳定性筛选出能稳定高产蛋白酶的米曲霉菌株，并应用菌株优化发酵工艺：初始pH 5.5、30 ℃、发酵48 h、接种量9%、摇床培养转速160 r·min-1条件下水解豆粕程度达到24.05%[41]。于潇淳分别从短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉中扩增到碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的基因，在通过生物学方法转入到米曲霉菌株中，并选育获得高效表达酶活菌株发酵豆粕，工程菌碱性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力较野生菌株高140%和242%，其对豆粕原料水解率和多肽转化率均较野生型菌株有所提高[42]。惠明等采用枯草芽孢杆菌和米曲霉混合接种比例3∶1（v/v）、接种量2%、40 ℃培养、发酵60 h，发酵豆粕中游离氨基酸较发酵前有显著提高[43]。黄永锋优化米曲霉产中性蛋白酶最优培养基及条件为：豆粕8.8%、麸皮35.2%、水55%、KH2PO41.0%、接种量为11%、在30 ℃培养108 h，在此条件下测得中性蛋白酶酶活力为5 863.5 U·g-1，应用至豆粕中接种干米曲13%，30 ℃发酵24 h，酶活力4 523.5 U·g-1，水解度23.1%，还原糖含量6.5%[44]。史玉宁等采用米曲霉和酿酒酵母在水分45%、米曲霉、酿酒酵母接种量分别为0.5%、4%，添加酶制剂0.1%的条件下，发酵豆粕粗蛋白质提高了21.27%、酸溶蛋白提高了695.97%[45]。黄明达等用响应面发优化米曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母组合发酵豆粕发酵条件：接种量10%（米曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母接种比例1∶1∶2）、发酵温度32 ℃、含水量60%、发酵72 h发酵豆粕的酸溶蛋白含量提高至20.73%[46]。

2.2 丝状真菌在发酵豆粕中应用工艺

丝状真菌的生长繁殖在满足营养条件下主要影响的因素有生长温度、湿度、氧气供应程度等。低温会抑制丝状真菌的酶活性及新陈代谢等，适宜的温度是菌株快速萌发生长的必备条件。很多新陈代谢及生化反应都是在有水的情况下进行的，因而湿度对丝状真菌的生长繁殖也很关键，此外丝状真菌的生长繁殖是与氧气不可分离的，没有氧气丝状真菌很难生长繁殖。在多菌种混合发酵中，还会与其他微生物产生颉颃作用或者协同作用，不同菌株有不同的表现需要视具体菌株而定。这些影响丝状真菌生长繁殖的因素也是其在发酵豆粕中应用工艺控制的技术要点[47]。豆粕浅层发酵工艺一般物料厚度＜5 cm，适用于纯好氧发酵或者前期好氧发酵，物料薄通气较好有利于氧气的充分扩散，而深层发酵物料厚度一般＞30 cm，主要适合前期好氧、中后期兼性厌氧发酵[48]。黄永锋采用前48 h用黑曲霉、枯草芽孢杆菌和酵母菌（接种比例4%、2%、2%，料水比1∶0.9）30 ℃好氧发酵，后48 h再接种植物乳杆菌（接种量2%，料水比1∶1.2）和瘤胃微生物37 ℃厌氧仿生发酵，此条件下发酵豆粕中胰蛋白酶抑制剂含量由发酵前的12.8 mg·g-1降低到0.1 mg·g-1，粗蛋白质含量由发酵前的43.75%提高到52.03%，乳酸含量达到2.13%，酸溶蛋白可达20.06%，此外发酵完后豆粕中蛋白酶活力可达491 U·g-1。考书娟等使用丝状真菌YW-7和乳酸菌混合，并采用浅盘培养工艺发酵豆粕，料水比1∶0.8、YW-7接种量2%、乳酸菌接种量1.5%、料层厚度控制在2～3 cm、30 ℃好氧发酵24 h后转为厌氧发酵48 h，发酵豆粕粗蛋白质＞53%，肽含量23%，总酸2.5%，豆粕中水苏糖、棉子糖降解去除效果显著[22]。刘建峰用枯草芽孢杆菌F-11-06进行前发酵（33 ℃、69 h），然后用黑曲霉F-11-08 和酵母菌F-11-12 进行后发酵（25 ℃、28 h），可将豆粕蛋白质的水解度提高到22.3%，其水解度较F-11-06 发酵的高6.8 倍较F-11-08和酵母菌F-11-12发酵的高330%[49]。

3 讨论与小结

丝状真菌在豆粕发酵中应用的菌株种类较少，据最新饲料添加剂目录中微生物种类显示，目前仅黑曲霉和米曲霉作为安全菌株可以添加到饲料中应用，这也是丝状真菌在发酵豆粕中应用较少的客观原因。丝状真菌在发酵豆粕中应用研究目前主要集中在辅助豆粕分解上，其在豆粕中代谢酶系、酸类物质等未进行深入和全面的研究，且丝状真菌在发酵豆粕中应用仍有巨大的潜力，需要深入研究和开发。黑曲霉可代谢产生葡萄糖氧化酶、单宁酶等，葡萄糖氧化酶可在鸡肠道内能催化葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，可抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌，保护肠道健康并改善肠道消化环境等[50]。单宁有止泻、抗炎等作用，可以结合蛋白质和金属离子等营养素并能破坏微生物细胞膜的完整性[51-52]。微生物合成单宁酶可用于抵抗单宁对其的毒害作用，因此黑曲霉分解单宁也可应用于止泻抗炎的功能性发酵料的开发上。此外，丝状真菌在发酵豆粕中应用与其他种属菌株复合发酵效果较好，主要与酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌等复合发酵，但其竞争力较强与其它种属菌株之间的协同颉颃作用研究较少，这也是导致丝状真菌在发酵豆粕中应用造成代谢产物、发酵指标不理想等问题的原因之一。相较于酵母、芽孢和乳酸菌工程菌构建研究，丝状真菌的工程菌构建较少，其工程菌构建的难度也较大，但这些丝状真菌工程菌构建工作意义重大。

丝状真菌在发酵豆粕中应用的潜力巨大，对丝状真菌在发酵饲料开发上进行深入和全面研究，不仅可为开发特殊功能性发酵豆粕提供理论基础，而且还能为其他原料的开发和利用提供启发式创新。