红枣桂圆复合果醋的酒精发酵工艺研究

陆丽珠，陈 韵，张 瑾，梁舒妍，钟先锋

（佛山科学技术学院 食品科学与工程学院，广东 佛山 528225)）

0 引言

红枣，又名大枣、枣子等，味甘性温、营养丰富，被称为“天然维生素丸”， 是我国传统的药食同源的食品，归脾胃经，具有补中益气、养血安神、缓和药性的功能[1-4]。

龙眼，性温味甘，其营养丰富，具有较高的食用价值和药用价值，通常以鲜食为主。由于每年龙眼种植面积广、产量高，但龙眼的保鲜期比较短和贮藏技术受到限制，有关龙眼的深加工并不多，每年都会有许多龙眼会因为无法得到有效的贮藏而浪费。因此，为解决龙眼的产量多而难储存的问题，提供了一种新的深加工途径[5-9]。

果醋是一种营养丰富、风味优良的酸性饮品或调味品。果醋含有10种以上的有机酸和人体所必需的氨基酸、碳水化合物等，果醋除了调味功能外还具有多种营养保健功能，如抗氧化、抗衰老、促进肠胃消化等功效[10-14]。目前市场上推出的果醋大部分是单一的果醋，复合果醋较为少见。随着生活水平的提高，人们对生活的品质越重视，口味单一、保健功能较少的果醋，难以满足现阶段生活水平较高、保健意识较强的消费者。结合红枣和龙眼需要继续深加工的问题和果醋的品种单一的问题，试验研究的红枣桂圆复合果醋符合消费者的需求和技术创新发展的要求，还能有效地解决红枣、桂圆种植产能过剩的问题。

由于目前的果醋相关研究大多都是关于醋酸发酵阶段的，酒精发酵阶段的研究较少。着重研究红枣桂圆复合果醋的酒精发酵阶段，为给果醋的发酵提供一种一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要原料

红枣、龙眼，均为市售；安琪葡萄酒、果酒专用酵母，安琪酵母股份有限公司提供；果胶酶，食品级。

1.1.2 仪器设备

ME204E型电子天平、FE28-Standard型数字式pH计，梅特勒-托利多集团产品；RHB-32ATC型手持折光仪，天垒仪表产品；HWS-12型恒温水浴锅、LRH-150型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 试验设计

1.2.1 工艺流程

①红枣（清洗、去核、破碎、浸提、灭酶杀菌、过滤） →红枣汁；

②桂圆（清洗、去皮、去核、打浆、灭酶杀菌、过滤） →桂圆汁；

①+②→混合→红枣桂圆复合果汁→加酶母菌→酒精发酵→果酒。

1.2.2 操作要点

（1） 红枣汁的制备。选择优质的红枣，将其去核、清洗，然后加3倍质量的清水放入破碎机进行粉碎。将粉碎后的红枣泥再加5倍质量的水，于70℃的恒温水浴中浸提1.5 h；向红枣浸提液中添加0.5%的果胶酶，于50℃恒温水浴继续浸提30 min；过滤，除去滤渣，滤液备用[15]。

（2） 桂圆汁的制备。选择优质桂圆，去壳、去核，用清水将桂圆肉淘洗干净；加3倍水煮沸后再在90℃下煮30 min；将桂圆肉与熬煮水一起送入打浆机中打浆；将打浆好的原料用80目滤网过滤，除去滤渣，滤液备用[16]。

（3） 酒精发酵。将红枣汁和桂圆汁按一定的比例混合均匀，再将红枣桂圆复合果汁的糖度调整到需要的糖度后，按比例接入酵母粉；把发酵液置于所需温度培养，一直到糖度不再发生变化时停止发酵；发酵后过滤，测定果酒的酒精度。

1.2.3 指标计算

可溶性固形物，手持折光仪法；pH值，数字式pH计测定法；酒精度，按照 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》 中的4.1.3酒精计法测定；细菌总数的测定，按照GB 4789.2——2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》规定方法测定；大肠菌群的测定，按照GB 4789.32016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》 规定方法测定。

1.2.4 试验方法

影响酒精发酵的主要因素有红枣汁桂圆汁的比例、酵母菌接种量、初始糖度、发酵温度等[17-20]。通过单因素试验，选出各因素最适宜的发酵条件，然后通过Box-Behnken响应面优化试验研究各因素对酒精度的影响，以确定红枣桂圆复合果醋酒精发酵的最佳工艺。

（1）单因素试验。从红枣汁桂圆汁的比例、酵母菌接种量、初始糖度、发酵温度4个方面进行红枣桂圆复合果醋酒精发酵单因素试验。根据参考文献和预试验得出的结果，设置红枣汁桂圆汁的比例水平为3∶1，2∶1，1∶1， 1∶2， 1∶3；酵母菌接种量水平为0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；发酵温度水平为26，28，30，32，34℃；红枣桂圆果酒初始糖度水平为16， 18， 20， 22， 24°Bx[21-23]。

（2）Box-Behnken响应面法优化酒精发酵条件。以单因素试验的结果为基础，使用Design Expert 8.0.6软件建立数学模型，以软件设计的方案进行试验。采用恒温培养箱静置发酵，对酒精发酵的条件进行优化，得出红枣桂圆复合果醋酒精发酵的最佳工艺。

1.2.5 数据处理分析

数据采用Microsoft Excel 2010统计分析、Design Expert 8.0.6软件分析及Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 红枣汁桂圆汁的比例对酒精发酵的影响

红枣汁和桂圆汁所含有的可溶性固形物种类和含量都不一样，两者的比例不一样，可溶性固形物的含量也不一样，各自含有的营养物质不同。相同可溶性固形物时，各自的有效营养物质也不一样。

红枣汁桂圆汁的比例对酒精发酵的影响见图1。

由图1可知，红枣汁和桂圆汁的比例不同对酒精度的影响并不高，但还是有一定的影响。红枣汁和桂圆汁的比例为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2时，酒精度呈现一直上升的趋势，红枣汁和桂圆汁的比例为1∶2，1∶3时，酒精度呈现一直下降的趋势。由此可知，红枣汁的比例不能太高，太高会影响酒精度。在红枣汁和桂圆汁的比例为1∶2时，此时产生了最多的酒精，酒精度为9.50%Vol。

2.1.2 酵母菌接种量对酒精发酵的影响

酵母菌接种量是影响酒精发酵的速度、发酵是否完全的一个重要因素。果汁里的营养物质一部分用于酵母菌的增殖，另一部分用于酒精的积累。当酵母菌接种量过高时，果汁里的部分原用于酒精积累的营养物质会被用于酵母菌的增殖，而影响了酒精的积累，从而酒精度会相对较少。而当酵母菌接种量过低时，则不利于酵母菌的增殖，从而发酵的速度会直接受到影响，发酵的速度会变慢，同时某一段时间内酵母菌的活力会很高，但随着发酵时间越来越长，酵母菌的活力会渐渐减弱，甚至会消失，如果发酵过慢会导致更多的营养物质不能得到转化，从而酒精度也会相对较少。

酵母菌接种量对酒精发酵的影响见图2。

由图2可知，酵母菌接种量为0.05%～0.15%，酒精度会随着酵母菌接种量的增加而呈现快速增大的趋势；酵母菌接种量为0.15%时，酒精发酵过程产生的酒精最多，此时有最高的酒精度10.5%Vol；酵母菌接种量为0.15%之后，酒精度会随着酵母菌接种量的增加而呈现先快速降低然后减慢的趋势。

2.1.3 发酵温度对酒精发酵的影响

酵母菌处在适宜自身生长的温度下，酵母菌能产生最多的酒精。如发酵温度过高或过低都不利于酵母菌的生长增殖，甚至是影响酒精的积累，同时酵母菌在不适宜自身生长的温度下，很容易感染杂菌，杂菌较易在此环境中成为优势菌，从而影响酒精发酵及其酒精的产生。

发酵温度对酒精发酵的影响见图3。

由图3可知，发酵温度为26～28℃时，酒精度呈上升趋势，会随着发酵温度的升高而增加；发酵温度为28℃之后，酒精度接近平稳后有下降的趋势。由此可得，28℃为酒精发酵最佳的发酵温度，这时的酒精度可达10%Vol。

2.1.4初始糖度对酒精发酵的影响

适宜的糖度会使酵母菌产出最多的酒精。过高的糖度会使酵母菌的糖化活力降低，从而影响酒精的积累。过低的糖度不利于酵母菌的生长增殖，酵母菌数量不够会影响到酒精的积累，产生的酒精就会较低。

初始糖度对酒精发酵的影响见图4。

由图4可知，初始糖度为16～20°Bx时，酒精度会随着初始糖度的升高而增加；初始糖度为20°Bx以后，酒精度接近平稳后有稍微下降的趋势，考虑到糖度不宜太高的问题，故选择糖度20°Bx为酒精发酵最佳的发酵糖度条件，此时的酒精度为10%Vol。

2.2 Box-Behnken响应面法优化酒精发酵条件

2.2.1 酒精发酵Box-Behnken响应面试验结果

根据单因素的结果，应用Design Expert 8.0.6软件，采用Box-Behnken Design建立数学模型，以红枣汁与桂圆汁比例（A）、酵母菌接种量（B）、发酵温度 （C） 、 初始糖度 （D） 为自变量， 以酒精度（Y） 为因变量共设计29个处理组。

响应面四因素三水平试验因素与水平设计见表3，Box-Behnken设计方案及响应值见表4。

表3 响应面四因素三水平试验因素与水平设计

表4 Box-Behnken设计方案及响应值

2.2.2 回归方程模型建立

以下为利用 Design-Expert软件对表 4的试验数据进行回归分析所建立的回归方程：

2.2.3 回归方程模型方差分析

回归方程模型方差分析见表5。

由表5可知，模型的F值为163.90，p＜0.01，表明模型具有极显著性，有0.53%的概率是由于噪声导致F值偏大；失拟项的数值为0.810 8＞0.05，表明该模型可以解释响应面中81.08%的可变性，失拟项对于误差不显著，影响因素与响应值之间的影响显著，说明该试验数据所建立的回归模型能够优化酒精发酵条件，试验误差小。模型决定系数为R2=0.993 9，0.987 9，说明该模型的拟合度较好，能用此模型对红枣桂圆复合果醋中酒精发酵过程的产酒量进行分析和预测。该模型中，各因素影响程度依次为C＞B＞D＞A，即发酵温度＞酵母菌接种量＞初始糖度＞红枣汁桂圆汁比例。

2.2.4 响应面交互作用分析

该模型中，通过F值检验，由p＜0.01得到，一次项B，C，D对产酒的影响极显著，二次项A2，B2，C2，D2对产酒的影响极显著，即发酵温度、酵母菌接种量、初始糖度对酒精度的影响极为显著；二次项中红枣汁桂圆汁比例、酵母菌接种量、发酵温度、初始糖度对红枣桂圆复合果醋中酒精发酵具有极显著影响，其他各因素相互之间的影响不显著（p＞0.05）。回归方程模型方差分析的结果与图5中的3D效应面图反映出的各因素间的交互作用相同。

各因素交互作用对酒精度的影响等高线和响应面见图5。

2.2.5 验证试验

根据回归方程分析，通过响应面Optimization程序得出模型最优添加量的预测值，即红枣汁桂圆汁比例为1∶2.18，酵母菌接种量为0.16%，发酵温度为27.70℃，初始糖度为20.25°Bx，在该优化条件下，酒精度的理论值是12.32%Vol。综合以上条件进行验证试验，重复3次试验，结果表明，得出红枣桂圆复合果醋酒精发酵过程中酒精度为12.30%Vol。该值与预测值比较接近，该模型具有较高的可信度，因此选取此值为红枣桂圆复合果醋酒精发酵的工艺参数。

表5 回归方程模型方差分析

3 讨论

3.1 红枣桂圆复合果醋酒精发酵

酒精发酵过程是通过单因素试验和响应面试验得出红枣桂圆复合果醋酒精发酵过程的最佳发酵工艺，其工艺为红枣汁桂圆汁比例1∶2.18，酵母菌接种量0.16%，发酵温度27.70℃，初始糖度20.25°Bx，酒精度的理论值是12.319 3%Vol，实际酒精度为12.3%Vol。通过数据分析，得出各因素影响程度依次为发酵温度＞酵母菌接种量＞初始糖度＞红枣汁桂圆汁比例。

3.2 与其他果醋加工工艺的对比

在研究果醋加工工艺的文献数据时，对各种数据进行比较，发现红枣桂圆复合果醋是有一定的优势。红枣和桂圆都是药食同源的滋补食品，将这二者与果醋结合起来，能使这三者的优点结合起来，为消费者提供了一种新的保健饮料。此外，目前市场上还没有出现红枣桂圆复合果醋，研究可为后期的研究工作和果醋的生产工艺提供一定的参考意义[24]。红枣桂圆复合果醋的酒精发酵阶段的研究，为给果醋的发酵提供一些理论依据。

3.3 果醋的发展前景

目前人们对果醋的研究主要停留在果醋的发酵工艺上，对果醋的作用机制、活性成分、增大产量等的研究还较少，这对果醋的发展有极大的影响。此外，果醋是一种新型的保健食品，目前市场上的果醋品种还比较少，在物质生活越来越丰富的今天，目前市场上的果醋难以满足消费者的需求。因此，深入研究果醋的作用机制、活性成分、提高产量和研发的新型果醋，对果醋的发展具有重要的意义[24-25]。

4 结论

以红枣和桂圆为原料，对红枣桂圆复合果醋在酒精发酵过程和醋酸发酵过程的发酵条件下进行优化研究。通过单因素试验和Box-Behnken响应面法得出了红枣桂圆复合果醋酿造的最佳工艺。酒精发酵过程，通过响应面Optimization程序得出模型最优添加量的预测值，即红枣汁桂圆汁比例1∶2.18，酵母菌接种量0.16%，发酵温度27.70℃，初始糖度20.25°Bx，在该优化条件下，酒精度的理论值是12.32%Vol。综合以上条件进行验证试验，进行3次重复试验，结果表明，红枣桂圆复合果醋酒精发酵过程中酒精度为12.30%Vol。