藏药熏倒牛种子及其萌发特性研究

柳娜，谢田朋，刘越敏，曲馨，景明

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

藏药熏倒牛(BiebersteiniaheterostemonMaxim.)为牻牛儿苗科熏倒牛属植物，药用部位为地上部分。藏名音译为明见赛保,民间又称为臭花椒、狼尾巴，为藏医专用和特色药材之一[1]。《晶珠本草》中记载熏倒牛味辛、苦，性寒，具有消肿止痛、清热解毒、凉血、祛风的功效，用于治疗各种炎症、结核、丹毒、疟疾、咽喉肿痛、胃痛、全身水肿、卒中等症[2]。主要分布在甘肃、青海、宁夏、四川等地区[3-4]。目前国内外学者主要集中研究熏倒牛的化学成分及药理药效等方面，有关熏倒牛的种子繁育未见报道，本试验开展熏倒牛的种子及其萌发特性研究，可为熏倒牛的应用开发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 熏倒牛种子于2018年10月采自定西市安定区团结镇联庄村，由甘肃农业大学陈垣教授鉴定为熏倒牛(BiebersteiniaheterostemonMaxim.)正品，野外采集的种子于实验室中自然分干，剔除不饱满不成熟的种子，置于具塞广口瓶中，室温保存备用；赤霉素 GA3(山东瑞普生物科技有限公司)；萘乙酸 NAA(四川国光农化股份有限公司)；吲哚乙酸 IAA(天津市科密欧化学试剂有限公司)；显微成像仪 (尼康-80i型，上海德沃斯科技仪器有限公司)；超纯水机(型号：FCR1502-UF-P，青岛富勒姆科技有限公司)；电子天平[型号：ME103E/02，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；电热恒温鼓风燥箱(型号：GZX-GF101-1-BS-Ⅱ/H，上海跃进医疗器械有限公司)；钢尺。

1.2 种子基本形态测定 熏倒牛种子形态及千粒重：采用立体显微镜下观察熏倒牛种子形状、颜色及大小。随机取风干的种子1 000粒称重，重复5次，换算种子的千粒重。

种子含水量测定[5]：称取1 g种子置于干燥至恒重的称量瓶中，于90 ℃烘箱中烘干，第一次称重时间为2 h，其次称重时间为每隔12 h一次，直至称重样品3次恒重为止，设置5组重复试验，计算平均值，种子含水量计算公式如下：

种子含水量(%)=(W0-Wt)/W0×100%

注：式中W0为烘干前种子的重量，Wt为烘干后种子的重量。

种子吸水率[5]：称取约1 g种子，置于培养皿中，加入种子3倍量的蒸馏水，置于(20±1)℃恒温培养箱中，每隔4 h取出种子吸干表面水分后称重，再放回培养皿中继续吸水，反复操作直至称重样品连续3次恒定为止，设5组重复，计算平均值。吸水率计算公式如下：

种子吸水率(%)=(Wt-W0)/W0×100%

注:式中W0为吸水试验前种子的重量，Wt为吸水后种子的重量。

1.3 种子萌发试验

1.3.1 不同培养温度处理 取约400粒种子，放入盛有浓度为25%的浓硫酸溶液中浸泡60 min，倒去溶液，用蒸馏水冲洗2～3次后，沥干水后用0.1%高锰酸钾溶液消毒20 min。取培养皿3个，分别垫2层干净的滤纸于培养皿中，编号1～3号，每皿摆放100粒种子，加盖，置于15、20、25 ℃的恒温培养箱中培养，在培养期间添加无菌水保持滤纸湿润，观察种子发芽情况[7]。

1.3.2 不同温度浸种处理 取约600粒种子，放入盛有25%的浓硫酸溶液中浸泡60 min，倒去溶液，用蒸馏水冲洗2～3次。将种子分别置于温度为20、30、40、50、60 ℃水中浸泡60 min。取出沥干水分后，各组用0.1%高锰酸钾溶液浸泡60 min，蒸馏水冲洗2～3次。取铺有2层润湿滤纸的培养皿，编号，将处理过的各组种子分别置于相应编号的培养皿中，每组重复3次。置于(20±1)℃的恒温培养箱中培养，在培养期间田间无菌水保持滤纸湿润，观察种子发芽情况。

1.3.3 不同植物激素处理 按照表1的设置分别配置5个浓度梯度的GA3、IAA、NAA作为试验组，以蒸馏水作为对照组；取一定量的熏倒牛种子置于盛有25% 100 mL的浓硫酸的烧杯中浸泡60 min，倒去溶液，用蒸馏水冲洗2～3次，依次放入有各组有编号的植物生长素浓度的烧杯中浸泡60 min，对照组为用蒸馏水处理，浸泡30 min。各组用0.1%的高锰酸钾溶液消毒20 min，用蒸馏水冲洗2～3次。取培养皿，按照分组，将处理后的种子置于铺有2层湿润滤纸的培养皿中，放入(20±1)℃中进行种子萌发试验，在培养期间添加无菌水以保持培养皿中湿润，观察并记录种子的发芽情况，从萌发开始至种子不在萌发，计算其种子的发芽率和发芽势。

表1 不同植物激素及浓度设置

1.3.4 种子发芽率、发芽势及最终发芽率的计算[8-10]

种子发芽势(%)=(发芽高峰期天数内发芽种子总数/供试种子数)×100%

种子发芽率(%) =(规定时间内发芽种子总数/供试种子数)×100%

最终发芽率(%)=(最终发芽种子数/供试种子数)×100%

根长的测定：萌发结束后，按照随机选株的方式，从每个培养皿中选取5株，用刻度尺分别测量根的长度。

1.3.5 试验管理 试验开始之后，每天观察记录，保持滤纸湿润，记录种子萌发时间(以种子突破种皮，长度达到种子一半时记为萌发)培养20 d后，统计种子萌发数，记为发芽铝盒发芽势，取3次平均值。

1.3.6 数据处理 试验数据用Excel统计，SPSS17.0统计分析。

2 试验结果

2.1 熏倒牛植株及种子基本形态 熏倒牛植株根粗壮,纺锤形,表皮褐色和黄褐色；茎直立，呈圆柱状，有明显的纵棱,表皮黄棕色至棕褐色,密被黑色腺毛和柔毛；多叶少枝，有棕色托叶，叶互生,呈倒披针形,叶片 2～3回羽状深裂或全裂；小裂片条状披针形,皱缩；着生长黄褐色柔毛和腺；花序长，叶状苞片，披针形，为单毛所覆盖，花瓣 5,倒卵形,淡黄色,排列紧密,与萼片等长或稍短。花萼 5,宿存,黑色,被腺毛和柔毛。熏倒牛种子呈肾型，种皮有皱纹，呈棕褐色，较坚硬，长约2 mm，宽约1.5 mm，如图1所示。

试验结果显示熏倒牛种子的千粒重为2.929 g，种子含水量为5.84%，吸水曲线如图2所示，熏倒牛种子吸水特点总体上前24 h吸水量直线上升，至24 h吸水率达到46.8%，在30 h之后，吸水速率逐渐减缓，直至42 h后趋于饱和，48 h吸水率为53.2%。

2.2 熏倒牛种子萌发试验结果

2.2.1 不同培养温度对熏倒牛种子萌发的影响 种子萌发是指种子从吸胀作用开始的一系列有序的生理过程和形态发生过程。而温度直接影响种子内部营养物质的分解和其他一系列的生理活动，不同温度对熏倒牛种子的萌发影响(见图3)。

由图3可知，在10～25 ℃温度范围内，随着温度的升高，发芽率提高，发芽速度加快，温度对于熏倒牛种子的发芽率和发芽势以及最终发芽率的影响趋势相似。其中在25 ℃条件下发芽率、发芽势最高，分别达到31%和 37%。不同的温度条件下熏倒牛种子的发芽率势和发芽率存在差异，除20 ℃与25 ℃条件下发芽率和发芽势差异不显著外，其他各组间差异具有统计学意义(P<0.05)，即说明温度达到20 ℃后，温度的增加对于发芽率的影响不大。

2.2.2 不同浸种温度处理对于熏倒牛种子萌发的影响 采用不同温度进行浸种处理旨在研究不同温度对于打破熏倒牛种子休眠的影响，研究结果如图4所示。

由图4可知不同温度对于熏倒牛种子的萌发具有一定的影响，20 ℃与60 ℃发芽势差异不显著，30 ℃与50 ℃发芽率差异不显著，40 ℃与50 ℃浸种温度条件下熏倒牛种子的发芽率和发芽势差异均不显著外，其余各组不同温度下发芽率和发芽势差异具有统计学意义(P<0.05)。其中40 ℃浸种处理发芽率最高，发芽率和发芽势分别达到 22%和24%，比20 ℃高12%。

2.2.3 不同植物激素对于熏倒牛种子萌发的影响 植物激素是植物自身合成的具有调节植物生长发育功能的有机物质，对于种子萌发和植物的生长发育具有多方面的调节作用。本试验研究了不同浓度梯度的GA3、IAA、NAA对于熏倒牛种子萌发的影响，研究结果如图5～7所示。

试验结果表明，在一定的浓度范围内，随着植物激素浓度的增加，熏倒牛种子发芽率逐渐提高，当浓度超过临界浓度时，表现出抑制作用。GA3与IAA对于熏倒牛种子萌发的临界浓度相同，均为180 mg·mL-1。其中GA3作用下的熏倒牛种子的发芽率、发芽势和最终发芽率分别为53%、31%和58%；IAA作用下的熏倒牛种子的发芽率、发芽势和最终发芽率分别为46%、31%和49%。而NAA对于熏倒牛种子萌发的临界浓度为140 mg·mL-1，发芽率、发芽势和最终发芽率分别为32%、21%和39%。3种植物激素在不同浓度梯度下对于熏倒牛种子萌发的影响具有一定的差异性，其中GA3组除140与220 mg·mL-1浓度条件下发芽率与发芽势差异不显著外，其他各组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；IAA除60与120、220 mg·mL-1浓度条件下差异不显著和120与220 mg·mL-1浓度条件下差异不显著外，其他各组间差异具有统计学意义；NAA除0与60 mg·mL-1、220与180 mg·mL-1、140和60 mg·mL-1浓度条件下差异不显著外，其他各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

同一浓度下比较结果显示GA3与IAA在各浓度梯度下对于熏倒牛种子的萌发作用不存在显著性差异，但与NAA在180 mg·mL-1浓度下差异具有统计学意义(P<0.05)，IAA与NAA在140 mg·mL-1和180 mg·mL-1浓度下差异具有统计学意义(P<0.05)。由此可以看出，本试验中3种植物激素对于熏倒牛种子萌发的影响，表现为GA3>IAA>NAA。即GA3对于种子萌发的作用最强，最佳浓度为180 mg·mL-1。

2.2.4 不同浓度的植物生长激素对于熏倒牛幼苗根长的影响研究 不同的植物生长激素对于熏倒牛幼苗根长有一定的促进作用，不同的植物生长激素对于幼苗根长的影响趋势相同，植物激素浓度与幼苗根长存在正相关，相同的试验时间内3种植物激素不同浓度条件所对应的幼苗根长如图8所示，其中GA3对于幼苗根长的促进作用最强，0 mg·mL-1GA3作用下幼苗根长仅为2 mm，而220 mg·mL-1浓度下根长最长，达到4.1 cm，如图9所示。不同浓度下的植物激素对于熏倒牛幼苗根长存在差异，其中GA3除120与180 mg·mL-1差异不明显外，其他各浓度之间存在显著性差异(P<0.05)；IAA除120与0、140 mg·mL-1没有显著性差异，其他各组间差异显著(P<0.05)。NAA除120与140、180与220、140 mg·mL-1组差异不显著，其他各组间存在显著性差异(P<0.05)。同一浓度下3种激素的比较结果显示GA3与IAA、NAA在140 mg·mL-1与220 mg·mL-1浓度梯度下存在显著性差异，IAA与NAA在100 mg·mL-1浓度下具有显著性差异，其余各组差异不显著。

3 结论与讨论

种子萌发受多种因素影响， 包括外部的生态环境因素和内部的生理因素[11]。熏倒牛种子种皮坚硬，结构致密,透水、透气性较差，同时种子内部受到脱落酸(ABA)和香豆素等物质的抑制，是致使其休眠的主要原因。采用不同温度浸种处理或采用外源性植物激素能够增强其透水性、透气性，也能消除种子抑制物质，促进植物提早发芽[12]，本试验研究结论如下。

3.1 采用不同培养温度处理熏倒牛种子结果显示种子在25 ℃条件下发芽率、发芽势最高，各组之间统计学分析结果表明温度达到20 ℃后，温度的增加对于发芽率的影响不大。熏倒牛多分布在海拔1 000～3 700 m的黄土山坡、海滩地和草坡地，温度在10 ℃以上的季节多在5月中下旬，考虑到要充分利用季温和出苗率，生产上熏倒牛的直播时间应接近5月中下旬为益。

3.2 采用不同的浸种温度处理熏倒牛种子发现，随着浸种温度的升高，种子发芽率逐渐提高。当温度大于40 ℃时，种子发芽率逐渐降低，在60 ℃时种子的发芽率仅为4%。以上原因是熏倒牛种子种皮透水性好，超过40 ℃的水浸透种皮烫伤种胚，从而影响了种子萌发。

3.3 采用不同浓度的3种植物激素处理熏倒牛种子发现，在20 ℃条件下，种子第3天就开始发芽，第5天发芽旺盛，各处理组与对照组比较结果显示低浓度的GA3、IAA和NAA能够通过刺激细胞形成层的分裂，增强种子活力，促进萌发，当浓度超过临界浓度时，表现出抑制作用。其中GA3与IAA对于熏倒牛种子萌发的临界浓度相同，均为180 mg·mL-1、NAA对于熏倒牛种子萌发的临界浓度为140 mg·mL-1。同一浓度下本试验中3种植物激素对于熏倒牛种子萌发的影响强度，表现为GA3>IAA>NAA。统计不同处理条件下熏倒牛种子的发芽率和发芽势等发现，采用植物激素并不能彻底打破熏倒牛种子的休眠，原因概括如下：①应用外源萌发促进物质处理熏倒牛种子仅能解除部分休眠，而达不到层积处理过程中种子内部发生的一系列反应；②种子中存在其他抑制种子萌发的物质，植物激素并不能消除其影响[13-14]。因此，针对熏倒牛种子休眠机制的分析和萌发特性还应进一步深入研究。