索拉非尼联合三氧化二砷对肝癌表面耐药蛋白P-糖蛋白表达的影响及疗效观察

林榕生 吴楚海 王涛 李怀 陈荣斌 陆美华 李志兰

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)为高致死率的恶性肿瘤，近年来，随着环境污染、黄曲霉素、乙型肝炎病毒感染等问题的加剧，我国已成为全球肝癌发病率及病死率最高的国家[1]。HCC病情进展快，而且复发转移率高，超过80%患者确诊时已达晚期或已出现转移，化疗是晚期HCC综合治疗的重要手段之一，但肝癌细胞对化疗药物的多药耐药严重影响了化疗效果，约70%化疗后短时间内即发生耐药表现。研究表明，肝癌多药耐药在形成过程中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP)表达异常，P-GP与肝癌细胞多药耐药密切相关[2,3]。索拉非尼为多靶点酪氨酸激酶抑制剂，为治疗晚期HCC的一线靶向药物。目前，较多动物或体外实验证实索拉非尼联合三氧化二砷对肝细胞癌肺转移及血管生成具有明显的抑制作用[4,5]，但应用于临床的研究笔者所见鲜有报道。本研究中索拉非尼联合三氧化二砷治疗晚期HCC，旨在探讨其临床疗效及对耐药蛋白P-GP表达的影响，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1～12月我院肿瘤内科收治的90例初治原发性肝癌患者，男54例，女36例；年龄29～75岁，平均年龄(50.2±1.1)岁；TNM分级[6]均为Ⅳ期；按患者入院顺序随机分成2组，其中观察组35例，男21例，女14例；年龄29～73岁，平均年龄(50.5±1.8)岁；肝功能Child-Pugh分级[7]：A级31例,B级4例；淋巴结转移14例，无淋巴结转移21例。对照组55例，其中男33例，女22例；年龄29～75岁，平均年龄(51.3±1.4)岁；肝功能Child-Pugh分级：A级48例,B级7例；淋巴结转移20例，无淋巴结转移25例。2组患者年龄、性别、临床分期、肝功能Child-Pugh分级、淋巴结转移等均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究所有患者及家属对研究内容知情，且均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①经影像学或肝脏穿刺活检诊断为原发性肝癌者[8]；②TNM分期为Ⅳ期，且初次接受治疗者；③肝功能Child-Pugh分级≤9分者；④预计生存期≥3 个月者。

1.2.2 排除标准：①肝功能失代偿或合并慢性肝性脑病；②合并其他恶性肿瘤者；③心脏病、感染及肾功能不全者；④孕妇或哺乳期女性。本研究经本院伦理委员会审批。

1.3 治疗方法 所有患者采用肝动脉化疗栓塞治疗，检查确认无砷类药物的禁忌证后，对照组患者化疗期间给予三氧化二砷注射液(北京双鹭药业股份有限公司生产)10 mg/次，1次/d，静脉滴注，每次滴注3～4 h，连用1～4 d为1个疗程，间歇2周后重复,至少使用4疗程。观察组在对照组治疗基础上，在化疗后5 d给予口服甲苯磺酸索拉非尼片(德国BayerPharmaAG生产)0.4 g/次，2次/d，嘱患者空腹或伴低脂、中脂饮食服用；4周为1个疗程，连续服用4个疗程，每4～6周回访1次。

1.4 观察指标 (1)肝组织P-GP表达水平：本研究所有无法手术原发性肝癌患者，病理诊断取材前提下，2组在治疗前及治疗4个疗程后，采集肝癌组织、癌旁组织(癌组织旁1 cm)、正常组织(癌组织旁3～5 cm以外或最远处)，并拍摄记录标本外观取材部位。鲜肝组织用10%中性甲醛液固定，石蜡包埋，制成厚度4 μm 的组织切片备用。采用免疫组化S-P二步法进行检测,用0.01 mol/L pH值 6.0柠檬酸盐缓冲液进行高压抗原修复,用已知P-GP阳性切片(福州迈新生物技术开发有限公司提供)为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体作为阴性对照。结果判定标准：P-GP阳性染色为橙黄色颗粒状，每张切片在光镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个瘤细胞，由两位经验丰富的病理医师进行双盲结果判定着色强度，并参照：基本未见阳性细胞着色为-，记为0分；染色浅黄色未见明显有色颗粒者为+，记为1分；染色棕黄色且可见细有色颗粒者为++，记为2分；色深棕色且可见粗大有色颗粒者为+++，记为3分；并计算阳性性细胞占比：0分：0；1分：<33%；2分：3%～66%；3分：>66%；二者之和≤2分定义为低表达，3～6分为高表达[9]；(2)近期疗效：2组患者治疗前后均经彩超及CT检查，治疗后根据实体瘤近期客观疗效评定标准[10]，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)及进展(PD)4个，计算有效率(RR)=CR+PR，疾病控制率(DCR)=CR+PR+SD；(3)远期疗效及不良反应：采用门诊或电话方式随访至2019年2月25日，比较2组患者疾病进展时间(TTP)及1 年生存率；并参照美国国立癌症研究所NCI-CTC 3.0版[11]评价随访期间药物不良反应发生情况。

2 结果

2.1 2组肝组织P-GP表达水平 癌组织中P-GP主要表达于细胞膜及细胞浆中，呈棕黄色；对照组癌组织、癌旁组织及正常组织中P-GP表达的阳性率分别为69.09%、32.73%、16.36%，与观察组各组织中P-GP表达的阳性率(68.57%、28.57%、14.29%)比较差异无统计学意义(P>0.05)；给予不同方案治疗后，对照组患者各组织中P-GP表达阳性率较治疗前下降，但差异无统计学意义(χ2=1.682，P=0.263；χ2=3.153，P=0.508；χ2=0.936，P=0.863)；观察组患者癌组织及癌旁组织P-GP表达阳性率较治疗前明显降低(χ2=5.824，P=0.022；χ2=6.182，P=0.014)，但正常组织中P-GP表达阳性率治疗前后差异无统计学意义(χ2=3.252，P=0.093)；观察组患者癌组织及癌旁组织中P-GP表达阳性率均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；但2组正常组织中P-GP表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组治疗前后不同组织P-GP阳性表达结果比较 例(%)

注：与治疗前比较，*P<0.05

2.2 2组近期临床疗效比较 观察组总有效率及疾病控制率(40.00%、85.71%)明显高于对照组(23.64%、60.00%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者临床疗效比较 例(%)

2.3 2组远期疗效疗效比较 截至末次随访日期2019年2月25日，其中对照组失访2例，随访53例，随访率为96.36%；观察组失访1例，随访34例，随访率为97.14%；观察组患者中位TTP为6.8个月，12个月生存率为57.14%；对照组患者中位TTP为6.2个月，12个月生存率为52.73%；观察组中位TTP及12个月生存率均高于对照组，但2组差异无统计学意义(t=2.937，P=0.127；χ2=3.054，P=0.084)。

2.4 2组不良反应发生情况分析 2组患者主要出现消化道反应、手足及皮肤、骨髓抑制等不良反应，2组不良反应发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2组治疗后不良反应发生情况比较 例(%)

3 讨论

研究表明，肝癌细胞内多药耐药基因(MDR1)编码的糖蛋白(P-GP)过度表达是引起肝癌细胞多药耐药的主要原因[12]，并有研究阐明P-GP参与了肝癌的发生、发展及转移[13]。 P-GP是一种跨膜糖蛋白,属于ABC转运超蛋白家族，在ATP参与下在细胞膜上形成ATP依赖性流出泵，当抗肿瘤药物进入时，将亲脂性药物泵出胞外，导致细胞内药物浓度低于有效剂量，引发肝癌细胞耐药[14,15]。在肺癌、胰腺癌治疗中，通过抑制肿瘤细胞P-GP的表达，可明显降低肿瘤细胞耐药率，为肝癌的治疗提供了新的思路。

索拉非尼为多靶点酪氨酸激酶抑制剂，其通过的抑制RAF/MEK/ERK通路中Raf激酶活性，从而阻断该通路信号介导的一系列反应，可有效抑制肿瘤细胞增殖；同时通过抑制VEGFR、PDGFR-β等新生血管生成因子，从而抑制肿瘤新生血管形成，延长患者生存期，是治疗原发性肝癌临床治疗的一线分子靶向药物。三氧化二砷为凋亡诱导剂，可有效抑制肝癌细胞增殖，并诱导其凋亡。研究显示，单用索拉非尼或三氧化二砷用于治疗原发性肝癌有效率仍不容乐观[16，17]。林晓花等[16]研究显示，采用索拉非尼联合肝动脉的栓塞化疗(TACE)治疗晚期肝癌客观有效率为38.2%，疾制病率为69.6%；而颜廷华等[17]采用三氧化二砷联合TACE治疗中晚期原发性肝癌总有效率为20.0%，疾病控制率为80.0%；本研究采用索拉非尼联合三氧化二砷治疗晚期原发性肝癌，结果显示总效率及疾病控制率分别40.00%、85.71%，明显高于单用三氧化二砷治疗组。本研究总效率及疾病控制率均优于单用索拉非尼或三氧化二砷治疗肝癌的相关研究。同时，本研究结果显示，索拉非尼联合三氧化二砷治疗组中位TTP为6.8个月，12个月生存率为57.14%，明显优于单用三氧化二砷治疗组，且出现消化道反应不良反应、手足及皮肤反应、骨髓抑制等不良反应与单用三氧化二砷治疗组无明显差异，提示索拉非尼联合三氧化二砷治疗晚期肝癌临床疗效显著，且安全性较高。

另外，本研究结果显示，癌组织、癌旁组织及正常组织中P-GP表达的阳性率分别为69.09%、32.73%、16.36%，与周业庭等[18]研究结果基本一致。给予2组不同用药方案治疗后，索拉非尼联合三氧化二砷治疗组患者癌组织及癌旁组织P-GP表达阳性率呈明显降低，且降低程度大于单用三氧化二砷治疗组，但2组患者治疗前后正常组织中P-GP表达均无明显变化。提示联合索拉非尼后，可明显改善肝癌晚期患者癌组织及癌旁组织中P-GP过表达，提高临床疗效。研究显示，索拉非尼可明显降低人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/FU中P-GP表达的表达水平[19]；同时，喻喆等[20]体外实验表明，索拉非尼可显著降低人肝癌耐氟尿嘧啶细胞株BEL-7402/ 5-FU细胞对氟尿嘧啶、表柔比星及紫杉醇的耐药性，并认为索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药性可能是通过下调P-GP的表达实现的。本研究给予晚期肝癌患者给予索拉非尼联合三氧化二砷治疗后，疗效明显提升，且癌组织及癌旁组织P-GP表达明显下调，可能是索拉非尼作为P-GP转运底物，通过抑制P-GP或者其他ABC转运蛋白功能，增加肝癌细胞内化疗药物浓度，从而逆转肝癌细胞多药耐药性。

综上所述，索拉非尼联合三氧化二砷治疗原发性肝癌临床疗效显著，且可明显降低癌组织、癌旁组织中P-GP的表达，值得临床进一步推广应用。另外，本研究为单中心取样，且总体样本量较小，随访时间有待延长，对本研究结果造成一定影响。后续拟扩大样本量，进一步探讨索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药性的作用机制。