Sox2和ABCC5在乳腺癌中的表达及与化疗敏感性的关系

张鹏 徐洪燕 孙勇

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，已成为女性健康的主要威胁。乳腺癌的治疗方法主要为手术，化学疗法，放射疗法，分子靶向疗法和内分泌治疗的组合疗法[1-3]。然而，即使根据NCCN指南给予治疗，20%～40%的乳腺癌患者仍然患有疾病复发和转移的可能性。化疗不敏感是乳腺癌进展的最重要因素之一。多西他赛、表柔比星、环磷酰胺常联合用于乳腺癌化疗，其易导致化疗化疗不敏感引起乳腺癌的复发和进展[4,5]。Sox2是性别决定区Y相关的高迁移率族盒(sex-determining region Y-related high-mobility group box，SOX)基因家族的成员，并且已被发现在各种肿瘤中充当癌基因。研究表明Sox2在肝癌组织中上调并促进肝癌的发展，并且原癌基因C-fos通过靶向Sox2来促进乳肝癌的增殖，侵袭和转移[6,7]。ABCC5是ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族的成员，是一种ATP依赖性转运蛋白，其显著降低了化疗药物的细胞内浓度，这被广泛认为是化疗敏感性最常见的潜在基础，此外ABCC5已被发现在乳腺癌骨转移中相对于原发性乳腺肿瘤过度表达。研究还表明，ABCC5高表达的患者预后较差。在细胞试验中，发现ABCC5与培美曲塞对乳腺癌化疗耐药有显着相关性，转染ABCC5的乳腺癌细胞表现出化疗不敏感特性[8,9]。本研究拟探讨Sox2和ABCC5在乳腺癌中表达及与化疗敏感性的关系，为乳腺癌的早期诊断及治疗提供理论临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年3月至2015年8月在我院行手术切除并经病理证实的乳腺癌患者136例，符合美国国家综合癌症网(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012 版《NCCNCRC诊治指南》中的诊断标准[10]。手术切除标本后行病理检查以判定临床病理特征。同时取距乳腺癌组织>5 cm的正常乳腺组织为癌旁组。患者自愿提供乳腺癌及正常乳腺组织，用作分析Sox2、ABCC5 mRNA、蛋白的表达及与与临床病理特征的关系。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①患者术前未接受任何放、化疗；②所有患者(或患者直系亲属)签署知情同意书；③所有患者的预计生存期均>3 个月。

1.2.2 排除标准：①治疗期间，同步接受其他肿瘤化放疗的患者；②病史及随访资料不完整。本研究经济南市人民医院伦理委员会审批通过。

1.3 Sox2、ABCC5 mRNA水平的测定 根据制造商的方案，使用TRIzol Reagent(Life Technologies)提取总RNA。使用ReverTra Ace-αqPCRRT试剂盒(Toyobo，Japan)定量RNA并逆转录成cDNA。使用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(Tiangen，Beijing，China)进行成熟miRNA的RT-PCR。 qRTPCR扩增方案根据ABRE7500 Fast系统上SYBR®GreenRealtime PCR Master Mix(Toyobo，Japan)的用户指南进行。熔解曲线分析用于监测PCR产物的特异性。GAPDH用作对照。Sox2引物如下：正向，5’-GGACGTTCACAACCACACTG-3’;反向，5’-TCCCACTTTGGCATTCTAGG-3’Sangon Biotech，中国上海。ABCC5引物如下：正向，5’-CCAAGAAGTGTGGTGTCCTG-3’;反向，5’-ACAAAGTCGTAGGCGTCGTT-3’(Sangon Biotech，中国上海)。 GAPDH引物如下：正向，5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3’;反向，5’-TCTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。所有实验一式三份进行。分析qRT-PCR结果并表示为CT的相对miRNA或mRNA水平(循环阈值)值，然后将其转换为倍数变化，使用阈值循环(Ct)的值确定每个靶基因的mRNA表达。在与GAPDH比较后使用2-ΔΔCT方法计算相对表达。

1.4 免疫组织化学法测定Sox2、ABCC5的表达 EnVision两步法用于免疫组织化学法。将5 μm切片脱蜡至水，并在洗涤后用0.3%过氧化氢甲醇处理10 min。然后将切片置于微波炉中，用兔抗人Sox2(1∶80稀释)，ABCC5(1∶80稀释)多克隆抗体，进行抗原修复20 min，连续加入Sox2(1∶50稀释)和ABCC5(1∶50稀释)单克隆抗体。所有材料均购自Abcam(Cambridge，MA，USA)。将第一抗体置于4℃过夜，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，每次2 min。然后用自来水洗涤切片，用苏木精复染10 min(70%～100%)水平的醇脱水，每个水平3 min。之后，将切片置于二甲苯中5 min，最后安装并在显微镜下观察。PBS缓冲液用作阴性对照而不是第一抗体，乳腺癌阳性样品(北京中山金桥公司中国北京)用作阳性对照。在半定量评估中考虑百分比和强度，并分别计数上皮细胞和基质细胞。阳性细胞的百分比评分为0(0阳性细胞)，1(1%～25%阳性细胞)，2(26%～50%阳性细胞)，3(51%～75%阳性细胞)，或4(>75%阳性细胞)。Sox2、ABCC5免疫染色的强度评分为0(阴性)，1(弱)，2(中间)和3(强)。强度得分(0～3)乘以百分比得分(0～4)，最终得分为0(阴性)，1～4(弱表达)，5～8(中度表达)和9～12 (强烈表达)。评分为0～4的样品被认为是低表达，而评分为5～12的样品被认为是高表达的统计分析。所有组织切片的免疫组织化学数据由三名评估员评估，平均值为最终评分。

1.5 ELISA测定Sox2、ABCC5蛋白水平 4℃下常规制作正常乳腺、乳腺癌组织匀浆，采用酶联免疫吸附法(Sox2、ABCC5 ELISA试剂盒购于北京九洲天瑞科技有限公司)检测正常乳腺组织、乳腺癌组织匀浆中Sox2、ABCC5蛋白表达量。

1.6 化疗方案 化疗方案为多西他赛75 mg/m2(第1天)、表柔比星100 mg/m2(第3天)、环磷酰胺500 mg/m2静脉滴注(第7天)，7 d 为1个周期，共18个周期。

1.7 乳腺癌化疗敏感性判定 进展(PD)：有新病灶出现或肿瘤最大横径与纵径乘积增大25%以上；稳定(SD)：无有新病灶出现且肿瘤最大横径与纵径乘积增大不超过25%，缩小<50%；部分缓解 (PR)：肿瘤最大横径与纵径乘积缩小>50%；完全缓解(CR)：肿瘤消失。低敏感组为 SD+PD；高敏感组为 CR+PR。本文高敏感患者75例，低敏感患者61例。

1.8 随访 随访起始日期为术后第1天，随访截止日期为2018年8月31日。随访方式为电话随访，随访内容为：生存质量、病情变化、治疗效果、恢复情况等。

2 结果

2.1 癌旁组、乳腺癌组中Sox2、ABCC5 mRNA水平的表达 乳腺癌组Sox2 mRNA、ABCC5 mRNA表达水平高于癌旁组 (t=19.326、12.326，P<0.05)。见表1。

表1 癌旁组、乳腺癌组中Sox2、ABCC5 mRNA水平的表达

2.2 Sox2、ABCC5在癌旁组、乳腺癌组中的免疫组化表达评分及阳性率 Sox2 主要定于细胞膜和细胞质，呈黄色或深棕黄色颗粒，ABCC5 阳性为细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒；乳腺癌组Sox2阳性102例、ABCC5阳性106例，乳腺癌组Sox2、ABCC5阳性率高于癌旁组(χ2=118.708、24.901，P<0.05)；乳腺癌组Sox2、ABCC5蛋白表达评分高于癌旁组(t=15.903、24.091，P<0.05)。见表2，图1。

表2 Sox2、ABCC5在癌旁组、乳腺癌组中的免疫组化表达评分及阳性率 n=136,例(%)

图1 Sox2、ABCC5在癌旁组、乳腺癌组的表达;A Sox2在癌旁组中表达；B Sox2在乳腺癌组中表达;C ABCC5在癌旁组中表达；D ABCC5在乳腺癌组中表达(免疫组化×200)

2.3 癌旁组、乳腺癌组中Sox2、ABCC5蛋白水平的表达 乳腺癌组Sox2、ABCC5蛋白表达水平高于癌旁组(t=113.821、88.774，P<0.05)。见表3。

2.4 Sox2、ABCC5蛋白表达与临床病理特征的关系 Sox2、ABCC5蛋白表达与年龄相关性不明显(χ2=0.348、2.429，P>0.05)；与肿瘤最大径、病理学分级、TMN分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发相关性明显，且肿瘤最大径≥5 cm、病理学分期越高、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发，Sox2、ABCC5蛋白阳性表达率越高(χ2=21.889、17.231、32.026、24.764、49.788、13.782、23.791、15.460、19.436、20.424、17.352、15.631，P<0.05)。见表4。

表3 癌旁组、乳腺癌组中Sox2、ABCC5蛋白水平的表达

2.5 Sox2、ABCC5蛋白表达与化疗敏感性的关系 Sox2、ABCC5蛋白表达与化疗敏感性相关性明显，且化疗敏感性越低，Sox2、ABCC5蛋白阳性表达率越高(χ2=36.560、15.460，P<0.05)。见表5。

表4 Sox2、ABCC5蛋白表达与临床病理特征的关系 例(%)

表5 Sox2、ABCC5蛋白表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.6 Sox2、ABCC5蛋白表达水平与乳腺癌患者预后分析 Sox2、ABCC5阴性组3年生存率及生存期均明显高于Sox2、ABCC5阳性组(χ2=35.211、37.816、Z=17.954、18.065，P<0.05)。见表6，图2。

表6 Sox2、ABCC5蛋白表达水平与乳腺癌患者预后分析

图2 Sox2、ABCC5 阳、阴组 Kaplan-Meier生存曲线分析

3 讨论

Sox2表达失常已经涉及许多严重的临床疾病，包括人类癌症。功能获得和功能丧失实验均表明Sox2在体外和体内有助于肝癌细胞增殖和致瘤性质，而在细胞水平，Sox2通过促进G1至S转变促进细胞周期进展[11]。Sox2是含有HMG结构域的转录因子，通过其下游靶基因的转录调节发挥其生物学活性。γ-晶状体蛋白、成纤维细胞生长因子4(fgf4)、细胞转录因子(UTF1)，N-cadherin和Oct3/4已被确定为Sox2的转录靶标基因。在这些基因中，UTF1已经显示出被Sox2转录调节并介导Sox2在促进细胞增殖和肿瘤发生中的作用。UTF1的蛋白质产物细胞周期蛋白D1是在细胞周期的G0/G1至S转换中起作用的关键调节剂之一[12]。因此，Sox2在促进G0/G1至S转换与UTF1在细胞中扩增和(或)过表达的行为一致，是癌症中最普遍的改变之一。Sox2在乳腺中的致癌活性已在遗传修饰的小鼠模型中得到证实，其中UTF1过表达导致乳腺癌的发展，而Sox2消融导致小鼠对几种致癌基因诱导的癌症具有抗性。此外，Sox2-null小鼠显示出有缺陷的出生后乳房发育，这表明由于怀孕的性类固醇环境对肺泡上皮细胞的增殖缺乏所致[13]。本次研究结果显示，乳腺癌组Sox2 mRNA表达水平、Sox2阳性率、Sox2蛋白表达评分、Sox2蛋白表达水平高于癌旁组；Sox2与肿瘤最大径、病理学分级、TMN分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发相关性明显，且肿瘤最大径≥5 cm、病理学分期越高、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发，Sox2蛋白阳性表达率越高。这与上述讨论符合，同时也提示Sox2在乳腺癌中高表达，Sox2能促进乳腺癌进展

近期研究表明，ABCC5可能作为潜在的关键转移和阉割抗性相关的致癌基因，然而，其潜在的分子机制仍不清楚[14]。众所周知，增殖和转移是恶性肿瘤相关死亡的两个最常见原因。为研究ABCC5的功能，构建了稳定的ABCC5沉默/过表达LNCaP和PC-3细胞系，并研究了ABCC5的敲低/过表达对细胞增殖，迁移和侵袭能力的影响，结果表明ABCC5敲低可显着抑制体外PCa细胞系的增殖，用ABCC5敲低构建体转染后，PCa细胞变得不那么具有攻击性和侵袭性，这表明ABCC5在PCa中起到转移相关致癌基因的作用[15]。也提示ABCC5的沉默显着抑制肿瘤生长和体内转移。本研究结果中，乳腺癌组ABCC5mRNA、阳性率、蛋白表达评分、蛋白表达水平高于癌旁组；且ABCC5阳性表达率与乳腺癌临床病理特征相关明显。这也提示，ABCC5在乳腺癌中高表达，ABCC5能促进乳腺癌进展。

本研究同时发现，Sox2、ABCC5蛋白表达与化疗敏感性相关性明显，且化疗敏感性越低，Sox2、ABCC5蛋白阳性表达率越高。ABCC5作为关键的ABC转运蛋白分子之一，能够转运单磷酸化的核苷类似物，可以赋予对6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤和9-(2-膦酰基-甲氧基乙基)腺嘌呤的抗性[16]。此外，ABCC5也参与了抗紫外线药物的耐药性，该机制是基于ABCC5能特异性转运极性膦酸盐(6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶的单磷酸盐)至细胞外，ABCC5基因表达增加是细胞对化疗不敏感的基础[17,18]。本次研究结果与之符合。

综上所述，Sox2、ABCC5在乳腺癌组织的表达量高于癌旁组织，在乳腺癌的发生发展过程中起促进作用；Sox2、ABCC5与化疗敏感性负相关；Sox2、ABCC5阴性的患者能获得较好的预后。