夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓病理形态及组织中炎性因子表达的影响*

付 豪,梅继林,李庆琳,李晓宁

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

急性脊髓损伤(ASCI)为临床常见的机械性损伤，一旦发生损伤通常会遗留严重的神经功能障碍，且临床恢复较难，为患者的运动功能及心理带来巨大压力[1]。夹脊电针对于急性脊髓损伤的疗效目前已得到大量的临床验证，但对于其确切作用机制的研究并无确切结论[2]。本研究通过夹脊电针治疗急性脊髓损伤模型大鼠，统计各组大鼠前后运动功能及脊髓组织病理形态学及组织中IL-18、IL-1β及cleaved caspase-1表达的改变，旨在探究夹脊电针对急性脊髓损伤疗效可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，雌性，体质量为(220±10)g。所有大鼠均为正常饮食且分笼饲养，实验室温度保持在(25±1.0)℃，空气湿度保持在50%，光照按照昼夜循环进行。大鼠在实验开始前，首先接受7天时间的适应性饲养。实验过程符合国际相关的动物使用关怀标准。

1.2 试剂及仪器

大鼠白介素18酶联免疫吸附测定试剂盒(EK0592，中国博士德)；大鼠白介素1β(IL1β)ELISA检测试剂盒(EK0393，中国博士德)；cleaved caspase-1(WL03450，中国Wanleibio)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004a，中国万类生物)；石蜡切片机(RM2235，德国Leica)；无水乙醇(10009218，中国国药)；显微镜(DP73，日本OLUMPUS)；曙红Y，醇溶(A600190，中国sangon)；苏木精(H8070，中国Solarbio)；超纯水系统(NW10LVF，香港Heal Force)；电热恒温鼓风干燥箱(QH01-9030A，上海精宏)；二甲苯(X112051，中国国药)；电针仪(KWD-808 II，中国英迪)。

2 实验方法

2.1 动物分组

本次实验研究将大鼠按照随机分配的方法分为Sham组(假手术组)、Model组(模型组)和EA组(夹脊电针组)3组，然后每组再按照3天和7天两个时间节点分成两个亚组，每组6例，应用苦味酸溶液对大鼠进行标记。

2.2 模型制备及评价

在前期课题的基础上，本次研究中主要研究了通过Allen′s法改良脊髓损伤大鼠模型的制备效果与制备方法[3]。在手术开始前，对大鼠进行12 h禁食，但可以饮水，准备所需实验材料，大鼠称重后，以3.5 mL/kg的剂量，采用10%水合氯醛进行腹腔注射，致大鼠麻醉，然后固定在捆绑板，在第8肋的位置处定位T10棘突，在此处备皮，消毒。再对大鼠脊柱T10节段确定之后，纵行将大鼠的背部皮肤切开，切口长3 cm，移除皮下筋膜，钝性分离皮下组织，使T9～11节段的棘突暴露，然后剪断，应用小号止血钳夹住脊板，直到脊髓组织暴露，操作过程中注意不要破坏脊髓组织。将10 cm玻璃管垂直放置于已暴露出的脊髓组织正上方，使5 g的砝码沿玻璃管内从顶端自由下落，撞击下方脊髓，造成脊髓外力性损伤，脊髓局部用生理盐水进行反复冲洗，分层缝合伤口。

在砝码下落撞击后，大鼠出现明显的尾部摇动、痉挛扭动、双下肢回缩的情况，并且撞击部位出现充血情况就表示造模成功[4-5]。

在大鼠麻醉苏醒后，采用BBB评分对大鼠进行评估，评估在3分以下的排除出本次实验。

2.3 干预方法

2.3.1 Sham组(假手术组) 在脊髓暴露后，不做造模及其他处理，直接将伤口缝合，术后常规饲养，与EA组大鼠每天同步固定30 min。

2.3.2 Model组(模型组) 在模型制备成功之后进行伤口缝合，不开展治疗，与EA组大鼠每天同步固定30 min。

2.3.3 EA组(夹脊电针组) 在造模成功之后的3 h内采用夹脊电针进行治疗[6]。取穴参照实验动物针灸图谱，取大鼠双侧T9、T11节段夹脊穴进行针刺；操作流程：应用针灸针(华佗牌，规格：0.35 mm×13 mm)在消毒后进行穴位的刺入，刺入4～5 mm，然后将电针两极接在同侧夹脊穴上,正极为上，时间为30 min，频率为100 Hz，调节电流避免大鼠的背部肌肉出现抽动且挣扎后停止的情况。按照该方案每天治疗1次。

2.4 指标检测

2.4.1 BBB评分评定各组大鼠肢体运动功能 BBB评分法能根据臀、膝、踝、躯干等部位运动的协调情况，量化评价脊髓损伤大鼠肢体运动功能[7]，分值范围为0～21分，在7分以内属于后肢关节运动情况的内容，8～13分属于对运动的协调性与步态的评估，14～21分主要针对运动过程中肢体精细运动能否完成进行评估。所有大鼠分别在造模后3天、7天两个时间点使用BBB评分法观察各组大鼠肢体运动功能情况。

2.4.2 HE染色法观察大鼠脊髓组织病理形态学变化 36只大鼠均在3天、7天两个时间节点进行BBB评分后采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)进行腹腔注射，达到麻醉效果，在大鼠麻醉之后迅速断头致死，然后在冰盒上快速的于损伤处为中点进行对脊髓组织的提取，大概2 cm，将其置于4%多聚甲醛缓冲液中进行固定，保存备用。包埋后切至厚度为5 μm的蜡片。在切片架按顺序加入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各2 min，然后将切片浸泡于蒸馏水中2 min，使切片脱蜡至水。通过苏木-伊红溶液染色，通过显微镜观察染色组织的病理形态，并于200倍镜下拍照。

2.4.3 ELISA法检测大鼠脊髓组织IL-18、IL-1β表达 每组大鼠于3天、7天的时间节点进行BBB评分后采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)进行腹腔注射，达到麻醉效果，在大鼠麻醉之后迅速断头致死，然后在冰盒上快速的于损伤处为中点取出长度约为2 cm的组织，置于-80℃液氮中保存备用以待进行ELISA检测。

2.4.4 IHC法检测各组大鼠脊髓组织cleaved caspase-1表达情况 将固定后的脊髓组织修好块后自来水流水冲洗4 h，酒精中脱水，二甲苯中固定，直至标本透明为止，包埋后切成层厚为5 μm的薄片，放在60℃温箱中2 h，烘干，脱蜡至水，随后进行IHC检测。

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 BBB评分法观察各组大鼠运动功能

由表1可知，Sham组大鼠运动功能基本正常，Model组大鼠后肢运动功能障碍明显，对比Sham组大鼠有明显差异，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后，观察EA组大鼠的评分情况明显有所上升，与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明大鼠出现脊髓组织损伤后，运动能力下降，存在运动障碍，夹脊针刺治疗可以有效的优化并改善其运动能力。

3.2 HE染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态学变化

由封三彩图1可见显微镜主要显示为：Sham组大鼠脊髓组织无炎性细胞浸润、未观察到有组织水肿或者出血坏死等异常情况。Model组大鼠脊髓组织表现出严重的组织疏松，空泡形成，神经细胞较Sham组显著减少，且细胞形态改变明显，大量神经元死亡，可以明显看出炎性细胞浸润情况严重，还有一些核固缩与核染色情况明显加深，倾向于细胞的一侧，使得胶质细胞更多，且随时间推移呈加重趋势。EA组3天时大鼠脊髓组织病理改变与Model组类似，对比Model组的情况来看，神经细胞明显变多，炎性细胞的浸润情况也变多，还会出现大量的胶质细胞，这些情况相较于Model组有着明显的减轻趋势;在7天的时间点上，整体结构更加完整，大部分地方出现了神经细胞，且细胞的形状不规则，胞体及胞核正常。

表1 各组大鼠BBB评分比较分)

注：与Sham组比较,#P<0.05；与Model组比较,*P<0.05。

3.3 各组大鼠脊髓组织IL-18表达情况

由表2可知，Sham组中可以见到一小部分大鼠脊髓组织中存在的IL-18表达，以3天、7天作为时间节点观察，在这两个点上趋于稳定。与Sham组相比，Model组大鼠脊髓组织IL-18表达出现了升高状态，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。而通过夹脊电针治疗的方式展开治疗后，观察到EA组大鼠脊髓组织IL-18表达出现下降状态，7天节点与Model组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明大鼠脊髓组织促炎细胞因子IL-18出现升高情况主要是在大鼠的脊髓组织受到损伤的情况下，出现这种情况很可能表现出其参与脊髓炎症反应，本实验采用夹脊电针进行针刺干预效果明显，有效降低IL-18表达，减轻炎症损伤情况。

表2 各组大鼠脊髓组织IL-18表达

注：与Sham组比较,#P<0.05；与Model组比较,*P<0.05。

3.4 各组大鼠脊髓组织IL-1β表达情况

由表3可知，Sham组大鼠脊髓组织中有一小部分IL-1β表达，以3天、7天作为时间节点，在这两个节点上具备稳定的水平。Model组大鼠脊髓组织IL-1β表达出现了明显升高，与Sham组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。而通过夹脊电针治疗的方式展开治疗后，EA组大鼠脊髓组织IL-1β表达出现明显下降，尤其是在7天节点上，与Model组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明在大鼠脊髓受到损伤的情况下，大鼠的促炎细胞因子IL-1β表达相较于其他组大鼠有着明显的升高趋势，采用夹脊电针治疗可以有效的降低IL-1β表达，减轻炎性反应，使得炎症损伤得到明显恢复。

表3 各组大鼠脊髓组织IL-1β表达

注：与Sham组比较,#P<0.05；与Model组比较,*P<0.05。

3.5 IHC法检测各组大鼠脊髓组织cleaved caspase-1表达情况

由图2可知，Sham组大鼠脊髓中有一小部分cleaved caspase-1，主要呈现出棕黄色阳性表达状态，以手术后3天、7天作为主要的观察点，整体呈现出稳定的水平。观察Model组大鼠，脊髓组织中的cleaved caspase-1阳性细胞密度值升高，与Sham组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。EA组大鼠治疗后，大鼠脊髓组织中cleaved caspase-1呈现阳性细胞平均光密度值下降的情况，而在3天、7天的时间节点上，EA组相较于Model组差异具有统计学意义(P<0.05)。

注：与Sham组比较,#P<0.05；与Model组比较,＊P<0.05。图2 各组大鼠脊髓组织cleaved caspase-1阳性细胞平均光密度值(n=6)

4 讨论

“夹脊穴”靠近足太阳膀胱经与督脉，不仅具有局部的治疗作用，同时能够通过刺激背俞穴，从而疏通一身脏腑经气[8]。主要的治疗方法是将夹脊电针的导线两极接通脉冲电流，然后针刺入夹脊穴。根据现阶段的研究可以得知，在脉冲电流接通之后，人体内会产生电场，通过针刺的神经影响，促进纤维生长，使得炎症因子与营养因子得到明显释放，起到调节作用[9-10]。李晓宁等[11]临床发现，夹脊配合督脉电针治疗脊髓损伤患者，在ASIA评分的改善中有着明显的效果，并且对于MBI能力评分与感觉量表评分都能起到改善作用，相较于普通电针有着更加明显的治疗效果。吴磊[12]通过对ASCI模型大鼠实验研究，发现夹脊电针能够改善SCI大鼠脊髓组织炎性损伤，促进大鼠运动功能恢复。

现有研究证实，Caspase家族因子介导了一系列炎症反应，在ASCI的继发性损伤中起到了至关重要的影响[13]。在ASCI早期，Caspase家族炎性因子可作用于NLRP3信号通路，触发其后一系列细胞、分子水平的炎性反应，从而加重脊髓损伤。李庆琳等[14]经动物实验研究证实,夹脊电针能有效抑制ASCI中细胞焦亡的过程，其作用机制与降低大鼠脊髓组织中NLRP3及caspase-1的表达有密切关系。活化的Caspase-1通过进一步加工pro-IL-1β和pro-IL-18，最终形成并释放具有生物活性的IL-1β和IL-18，促使整个细胞焦亡过程完成。IL-1β属于IL-1家族，是一种具有多种生物学功能的细胞因子，IL-18同属白介素1家族分子，在分子结构层面和生物功能上与IL-1β有明显的相似性。过量的IL-1β和IL-18能够介导生物体内炎症反应的发生，打破正常机体组织中促炎症细胞因子和抑炎症细胞因子之间的平衡，诱发炎症反应，引起机体免疫功能紊乱，从而影响正常的生理功能。因此，Caspase-1、IL-1β与IL-18的水平能够直接反应机体内炎性反应的程度。

本研究结果显示,在3天、7天两个时间点上，Model组大鼠表现出较为严重的神经细胞受损；而EA组大鼠脊髓组织随着治疗的不断进行，对于神经受损的病症有着明显的效果，可以见到许多神经细胞出现再生情况，减少了空泡的出现，而EA组大鼠的BBB评分提高的主要结构基础就有可能为此。根据实验室检测结果，观察到脊髓损伤后模型组大鼠脊髓组织内Caspase-1、IL-1β与IL-18水平较假手术组明显上升；而在夹脊电针治疗后，3天、7天两个时间点，Caspase-1、IL-1β与IL-18的水平显著下降(P<0.05)，证实夹脊电针能够通过调控ASCI大鼠脊髓组织内NLRP3信号通路中的相关因子表达水平，从而改善ASCI大鼠运动功能。

综上所述，夹脊电针能够有效控制并减轻ASCI后脊髓组织的炎性损伤，促进ASCI大鼠运动功能的恢复，该过程可能与下调脊髓组织中Caspase-1、IL-1β与IL-18的表达有关。