电针联合康复训练对急性骨骼肌损伤大鼠nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表达的影响*

于 杨,郭文海,高艺书,韩玉生△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

骨骼肌损伤好发于四肌与臀部，以钝挫伤或牵拉伤为主，外力的直接或间接作用引起肌纤维受到过度的压力和牵拉，造成骨骼肌纤维断裂，引起组织炎症、水肿、变性和坏死等病理改变[1]。骨骼肌损伤后容易形成瘢痕修复，愈合所需时间长且极易导致再次损伤，骨骼肌损伤后再生修复研究成为国内外热点[2]。本研究观察电针联合康复训练对急性骨骼肌损伤模型大鼠神经肌肉接头相关蛋白nestin、Cdk5和ε-nAChR动态表达的影响，探讨其对骨骼肌损伤修复的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量(250±20)g，动物合格证号SCXK(鲁)20140001，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。在清洁级实验室中正常喂养，室温(24±2)℃，湿度55%～60%。

1.2 主要试剂及仪器

蛋白质抽提试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自赛诺博公司；nestin、Cdk5和ε-nAChR一抗购自CST公司；GAPDH抗体、HRP标记山羊抗小鼠/兔IgG、标准蛋白 marker等均购自武汉博士德生物工程有限公司。

2135型组织切片机(德国菜卡)；Moticam3000显微摄影成像系统(美国Motic)；低温高速离心机(科大创新);电泳仪、垂直电泳槽、转移槽(北京六一仪器厂)；ThermoForma725(美国Forma公司)；凝胶成像系统(以色列MiniLumi公司)。

1.3 大鼠急性骨骼肌损伤模型制备

参考文献[3-4]，大鼠称重后用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，右后肢用脱毛剂脱毛，大鼠俯卧右后肢外展且膝关节呈90°屈曲，固定充分暴露腓肠肌。打击器钢球重量200 g，下落高度100 cm，打击部位腓肠肌中段面积1 cm2。造模后观察打击部位皮肤完整无破损，胫腓骨未发现骨折，局部组织出现肿胀等急性骨骼肌闭合性性损伤表现则为成功。

1.4 分组及干预方法

模型制备成功的大鼠随机分为模型组与干预组，每组12只，再随机分为7天与14天两个时间点，每个时间点6只，另取6只大鼠为正常组。造模成功后，大鼠立即进行制动和冷敷5 min，2天后开始进行相应干预。

干预组大鼠先进行跑台训练，跑台速度15 m/min，时间15min，每日1次。跑台训练后进行电针干预，参照实验动物穴位图谱[5-6]，大鼠固定后取局部损伤部位阿是穴、承山穴及承筋穴，局部常规消毒，使用0.25 mm×25 mm针灸针，针刺深度0.5 mm，连接电针仪，取疏密波，频率2 Hz，强度0.4 mA，持续20 min，每日针灸1次。连续干预6天后休息1天。正常组与模型组不做任何处理。

1.5 检测指标

1.5.1 骨骼肌HE染色 在干预7天、14天于末次针刺30 min后，麻醉大鼠，取出损伤部位的腓肠肌浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。经常规石蜡包埋后，进行切片，HE染色，Motic3000显微摄影系统在400倍镜下进行拍照，观察骨骼肌病理学变化。

1.5.2 WB法检测大鼠骨骼肌nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表达 取液氮冻存的腓肠肌组织0.5 g放入预冷瓷研钵中,研磨成极细的粉末，用蛋白抽提试剂抽提出蛋白，经BCA法蛋白定量后调整蛋白浓度，按WB步骤检测nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白，上样量为20 μg/孔，一抗浓度均为1∶500，二抗浓度1∶2 000。采用凝胶成像系统进行分析, 以目的蛋白与对照蛋白光密度的比值作为目的蛋白的相对蛋白表达量。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 各组大鼠骨骼肌病理变化

HE染色显示,正常组大鼠骨骼肌纤维形态规整，肌细胞染色清晰，无断裂、水肿和融解，未见充血和炎细胞浸润。模型组7天时可见肌纤维断裂，肌细胞肿胀融合，大量充血，炎症细胞浸润；14 h可见炎症细胞浸润明显增加，结缔组织增生明显，局部可见肌纤维坏死区。与模型组相比较，干预组7天、14天时肌纤维排列较规整，炎细胞明显减少，结缔组织增生和坏死区明显减少，新生肌纤维逐渐增多。见图1。

2.2 各组大鼠骨骼肌中nestin蛋白的表达

与正常组比较，模型组及干预组大鼠骨骼肌中nestin蛋白表达带明显增加(P<0.05)；与模型组比较，干预组大鼠骨骼肌中nestin蛋白表达明显增加(P<0.05)。模型组和干预组7天时nestin蛋白表达明显高于14天，呈下降趋势。见表1、图2。

表1 各组大鼠骨骼肌中nestin蛋白表达水平

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白的表达

与正常组比较，模型组及干预组大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表达带明显增加(P<0.05)；与模型组比较，干预组大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表达明显减少(P<0.05)。模型组和干预组7天时Cdk5蛋白表达明显高于14天，呈下降趋势。见表2、图2。

表2 各组大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表达水平

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05。

2.4 各组大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白的表达

与正常组比较，模型组及干预组大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表达带明显减少(P<0.05)；与模型组比较，干预组大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表达明显增加(P<0.05)。模型组和干预组7天时ε-nAChR蛋白表达明显低于14天，呈上升趋势。见表3、图2。

表3 各组大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表达水平

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05。

注:A.正常组,B.模型组7 d,C.模型组14 d,D.干预组7 d,E.干预组14 d。图2 各组各时间点大鼠骨骼肌蛋白表达

3 讨论

中医学认为急性骨骼肌损伤属于“筋伤”范畴，钝挫或牵拉等外力导致局部经脉受损、气机失利是其重要病理因素。早在《黄帝内经》中就有关于针刺治疗筋伤的记载：“一针皮，二针肉，三针脉，四针筋”。研究表明电针能促进骨骼肌损伤的修复进程[7]。跑台训练能够提高NADH 还原酶蛋白表达，激活肌卫星细胞来促进损伤骨骼肌的修复[8]；电针联合跑台训练能够更好地抑制瘢痕组织的形成，增加Agrin 蛋白表达，加速ACh受体聚合，从而促进骨骼肌损伤后NMJ 的重建[4,9]。

骨骼肌损伤后机体会启动自我再生修复机制，增殖的成纤维细胞所形成的瘢痕组织阻碍周围神经对肌纤维的支配作用，造成骨骼肌电生理传导功能障碍。神经肌肉接头(Neuromuscular junction,NMJ)是完成运动神经与骨骼肌信号传导的重要结构和功能单位，NMJ功能的完整对电生理信号传导和实现神经对肌肉的支配具有重要意义[10]。分布于NMJ突触后膜上的ε-nAChR特异性的表达于成熟的肌纤维中，能在极短时间内结合大量Ach，引发神经肌肉的电生理传导，被认为是NMJ损伤后电生理功能恢复的关键蛋白[11]。电生理信号传导与NMJ周围ACh受体簇集密切相关，ACh能通过nestin与Cdk5来抑制NMJ处ACh受体的簇集[12]，敲除Cdk5或nestin后Ach对其受体的解散作用被抑制，使细胞膜上的Ach受体大量表达；Cdk5或nestin过表达时，Ach对其受体的解散作用也增强，使Ach受体的表达相对减少[13]。

本实验结果中，急性骨骼肌损伤大鼠ε-nAChR蛋白表达量明显低于正常组，表明急性损伤对骨骼肌肉中ε-nAChR的表达有明显抑制作用。干预组不同时间点ε-nAChR蛋白表达量逐渐升高，可能是电针联合康复训练促进了损伤区域生成新的骨骼肌细胞，从而进一步生成大量的乙酰胆碱受体，促进NMJ电生理功能的恢复。急性损伤后大鼠骨骼肌中Cdk5和nestin蛋白表达均明显增加，电针联合康复训练后nestin蛋白在7天、14天表达量均高于同时间点的模型组，而Cdk5蛋白表达逐渐降低。表明急性骨骼肌损伤能够诱导Cdk5和nestin蛋白的表达，电针联合康复训练能促进骨骼肌中nestin蛋白的表达，抑制Cdk5蛋白的表达。

综上所述，电针阿是穴、承山穴和承筋穴，同时配合一定量的跑台康复训练能够通过抑制骨骼肌Cdk5蛋白表达，上调nestin和ε-nAChR蛋白表达，促进神经肌肉接头电生理功能的修复，从而改善大鼠骨骼肌急性损伤，表明电针联合康复训练对急性骨骼肌损伤是一种有效的干预手段。