红枣汁乳酸菌发酵生产γ-氨基丁酸的研究

余 偲，赵 育，张 晶，陈 悦，白莉圆，张宝善,2

(1.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，西安 710119；2.陕西省果蔬深加工工程技术研究中心，西安 710119)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)为一种天然的活性成分，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有降血压、治疗癫痫、缓解失眠和焦虑、合成大脑蛋白质[1]、调节血清中脂质水平[2]、抑制癌细胞增殖等诸多生理功效[3]。GABA已被作为一种新型的功能成分应用于食品、药品等领域。目前生产GABA方法主要有化学合成和微生物发酵，微生物发酵法安全、成本低，是目前最有应用前景的转化技术[4]。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是消耗碳水化合物产生乳酸的一类革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中[5]，对人体有许多有益的生理功能。经乳酸菌发酵后能够改善食品的口感、营养成分，提高食品贮藏性[6-7]。研究发现能够合成GABA的乳酸菌有短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、德氏乳杆菌(Lactobacillusgermanica)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等菌株[6]。

红枣汁中营养成分和添加物等都会影响发酵液中GABA的含量[6]，本试验利用植物乳杆菌和短乳杆菌混和发酵，研究红枣汁乳酸发酵过程中谷氨酸钠(sodium glutamate,MSG)、氮源、可溶性固形物含量、MgSO4、KH2PO4添加量对乳酸菌生产GABA的影响，以及发酵前后总酸、pH、氨基酸等指标的变化，开发出富含GABA的红枣汁乳酸发酵产品，为红枣资源高效利用，同时也为开发富含GABA的功能性食品提供一定的理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 发酵菌种 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，LP) CICC24202，短乳杆菌(Lactobacillusbrevis,LB)YM1301，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentans，LF)CGMCC1.1880，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei，LG)LG-11，肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，LM)CICC20714。

1.1.2 红枣汁加工 选用干净、无病虫害、无霉变的新疆干制骏枣。清洗干净，去核，按照红枣与水的质量比为1∶4加入纯净水，100 ℃预煮10 min，冷却后用打浆机破碎，按质量比加入 0.2%的果胶酶，在50 ℃下酶解3 h，用200目尼龙筛网过滤取汁，备用。

1.1.3 乳酸菌的扩大培养 将试验用的乳酸菌在MRS固体培养基上进行涂布，37 ℃培养24 h，挑取固体培养基上的单菌落转接到MRS液体培养基中，经过2次MRS液体培养基继代培养扩培；将菌悬液转移于5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入0.85%的无菌生理盐水清洗两次，再用无菌生理盐水悬浮，调整菌悬液浓度为1×108mL-1，备用[8]。

将试验用的红枣汁放入高压灭菌锅中，105 ℃下杀菌10 min，冷却至室温后，将乳酸菌转接至红枣汁中。

1.2 试验设计

1.2.1 发酵菌种的筛选 高产乳酸菌株的筛选：调整红枣汁可溶性固形物含量为15%，杀菌后，分别接入菌悬液浓度为1×108mL-1的LP、LB、LF、LG、LM，接种量按体积分数8%加入，发酵温度37 ℃，发酵时间60 h。

高产GABA菌株的筛选：在MRS液体培养基中加入5 g/L的MSG，其他条件同高产乳酸菌株的筛选。

1.2.2 不同发酵添加物对GABA产量的影响 MSG质量浓度：用葡萄糖调整红枣汁可溶性固形物含量为15%，分别添加0、2、4、5、6、8、10 g/L的MSG，杀菌后，接入菌悬液浓度为1×108mL-1的LP和LB，接种量按体积分数4%，发酵温度37 ℃，发酵时间60 h。

乳清粉质量浓度：在红枣汁中添加5 g/L的MSG，用牛奶乳清粉调节发酵液的氮源浓度，乳清粉的添加量分别为2、4、6、8、10、12 g/L，其他条件同MSG添加量单因素试验。

可溶性固形物含量：在红枣汁中添加5 g/L的MSG，10 g/L牛奶乳清粉，用葡萄糖和纯净水调整可溶性固形物含量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%。其他条件同MSG添加量单因素试验。

MgSO4质量浓度：在红枣汁中添加5 g/L的MSG，10 g/L牛奶乳清粉，调整可溶性固形物含量为20%，MgSO4作为硫酸根离子添加量分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 g/L[9]，其他条件同MSG添加量单因素试验。

KH2PO4质量浓度：在红枣汁中添加5 g/L的MSG，10 g/L牛奶乳清粉，调整可溶性固形物含量为20%，0.4 g/L MgSO4，KH2PO4作为缓冲盐添加量分别为2、11、20、30、40、50 g/L，其他条件同MSG添加量单因素试验。

1.2.3 响应面优化试验 通过“1.2.2”单因素试验，选择氮源(乳清粉)、可溶性固形物、 MgSO4、KH2PO4各因子进一步分析，设计4因素3水平Box-Behnken试验，因素水平编码见表1。

表1 中心组合设计试验因素水平表Table 1 Level table for test factor of center combination design

1.3 测定项目及方法

在红枣汁中添加5 g/L的MSG、11 g/L牛奶乳清粉、0.4 g/L MgSO4、15 g/L KH2PO4，用葡萄糖调整其可溶性固形物为20%，置于37 ℃条件下静置发酵，测定发酵过程中乳酸、pH、还原糖、总酚、GABA及氨基酸质量分数。

1.3.1 总酸、pH、还原糖及总酚 总酸采用酸碱滴定法(以乳酸计)[10]，pH用pH计直接测定。还原糖采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[11]，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，即为：y=0.628 7x- 0.001 9，R2=0.999 1。总酚采用福林酚法[12]。

1.3.2 GABA产量 采用HPLC法测定，参照黄俊[13]的方法并适当改动。Diamonsil C18色谱柱，柱温30 ℃，规格为250 mm×4.6 mm，紫外检测波长254 nm，进样量20 μL。流动相A为甲醇，流动相B为四氢呋喃、甲醇、0.05 mol/L醋酸钠(pH 6.2)，比例为(5∶75∶420)，流速0.8 mL/min，梯度洗脱。

衍生试剂的配制：称取邻苯二甲醛(OPA) 10 mg加入10 μL的β-巯基乙醇，再加入2.5 mL乙腈进行溶解，混匀，避光保存[14]。

0.4 mol/L硼酸缓冲液的配制：称取硼酸 24.7 g，加入1 L超纯水进行溶解，调节pH为10.4。

标准曲线的建立：以GABA标准溶液浓度为横坐标，通过高效液相色谱法测得峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，即y= 0.080 3x-2.072 8，R2=0.999 2。

样品测定：发酵后的红枣汁在8 000 r/min条件下离心10 min，取样液100 μL，加入0.4 mol/L的硼酸缓冲液1 mL和OPA衍生液200 μL，混匀后，衍生化反应30 min进样测定。利用已建立的标准曲线求出发酵液中GABA质量浓度[15]。

1.3.3 氨基酸分析 将红枣乳酸发酵液在8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液加入 6 mol/L盐酸，超声2 min，氮气吹扫2 min后封口；将消化管置于110 ℃烘箱22 h进行消化，过滤，取上清液用全自动氨基酸分析仪分析。

1.4 数据统计与处理

采用Excel 2010对试验结果进行处理分析，试验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

2.1.1 不同乳酸菌发酵过程中总酸和pH的变化 如图1所示，随着发酵时间的增加，总酸质量浓度呈现上升的趋势，这是由于乳酸菌利用红枣汁中的糖类物质代谢产生乳酸使酸度上升的结果[16]。当发酵时间为60 h，LP发酵红枣汁中乳酸质量浓度最大，从最初5.81 g/L增加到15.8 g/L，其次是LG和LB菌株，发酵时间大于60 h后，发酵液中的总酸质量浓度基本趋于 稳定。

图1 发酵过程中总酸质量浓度Fig.1 Total acid mass concentration during fermentation

由图2可知，pH随着发酵时间的增加呈现下降趋势，当发酵时间为60 h时，不同菌种发酵后LP使红枣汁pH变化最大，其次是LB和LG，这与总酸质量浓度分析结果基本一致，也表明LP在红枣汁中生长良好，能够加速发酵进程缩短发酵周期，同时产酸量增加能够降低物质的pH，使发酵后产品贮藏性能提高[17]。为了获得产酸量最高的菌株，选择LP作为发酵菌种。

图2 发酵过程中pHFig.2 pH during fermentation

2.1.2 不同菌种发酵对GABA产量的影响 由图3可知，当发酵60 h时，5种菌株中LB将MSG转化为GABA的能力最强，产生GABA质量浓度最多，为1 705.46 μg/mL，其次为LP、LF和LM菌株。为使发酵后的红枣汁饮品富含 GABA，选择产生GABA量最高的LB菌株作为发酵菌种。

图3 不同菌株发酵产GABA的能力Fig.3 Ability of different strains to produce GABA by fermentation

为了获得富含高产酸和高GABA的益生菌红枣汁饮品，通过上述的筛选结果，在接下来的试验中利用LP和LB混合菌种发酵红枣汁。

2.2 不同底物添加量对GABA产量的变化

由表2可知，不同底物添加量能够影响发酵液中GABA的质量浓度。MSG添加量在 2～5 g/L时，发酵液中GABA质量浓度呈现上升的趋势，超过5 g/L时，GABA质量浓度趋于平稳。这可能由于发酵液中高酸度和低pH限制了菌株对MSG的转化[15]，同时MSG添加量超过5 g/L时，会影响红枣汁的口感。因此，选择MSG添加量为5 g/L。

乳清粉添加量在2～10 g/L时，GABA质量浓度呈现增加的趋势，当添加量超过10 g/L，发酵液中GABA质量浓度逐渐降低。这可能是由于发酵液中氮源添加量过大，导致微生物过度生长老化，对GABA质量浓度产生了影响[18]。因此，选择乳清粉添加量为10 g/L。

可溶性固形物含量在5%～20%时，GABA质量浓度呈现不断增加，超过20%时，GABA逐渐下降，这可能是红枣汁中糖含量过高，渗透压变大，导致乳酸菌细胞脱水而活力下降使GABA积累量降低[19]，同时过高的可溶性固形物会使发酵液中糖含量过高导致口感降低。因此，选择可溶性固形物含量为20%。

MgSO4添加量在0.2～0.4 g/L，随着MgSO4质量浓度的增加，GABA合成量也在不断增加，说明MgSO4能够提高GABA的产量[9]。当添加量在0.4 g/L，MgSO4对菌体产GABA的促进作用最强；之后继续增大MgSO4添加量时，GABA合成量不断的降低，这是由于过高的硫酸根离子对菌体产GABA起到抑制作用。因此，选择MgSO4添加量为0.4 g/L。

KH2PO4的添加能够调节发酵液中的pH使GABA产量增加。当KH2PO4添加量为11 g/L时，GABA产量最大；当添加量超过11 g/L时，GABA质量浓度出现下降的趋势，这可能是过高的 KH2PO4质量浓度使得发酵液中K+浓度过高，对细胞渗透压造成了影响，使乳酸菌活力降低[20]。因此，选择KH2PO4添加量为11 g/L。

表2 不同底物乳酸菌发酵红枣汁中GABA质量浓度Table 2 GABA mass concentration in red jujube juice fermented by lactic acid bacteria under different substractes

2.3 响应面回归模型的建立与分析

以牛奶乳清粉、可溶性固形物含量、MgSO4及 KH2PO4添加量为4个因素，GABA质量浓度为响应值，设计Box-Behnken响应面试验，结果见表3。

根据Box-Behnken试验设计和响应面分析得出乳酸菌发酵红枣汁产GABA最佳工艺条件为：牛奶乳清粉添加量11 g/L，可溶性固形物含量21.81%，MgSO4添加量为0.44 g/L，KH2PO4添加量为14.91 g/L，在此最佳条件下产生GABA的理论值为417.196 μg/mL。

为了方便试验操作，在实际操作中稍作调整：牛奶乳清粉添加量11 g/L，可溶性固形物为20%，MgSO4添加量为0.4 g/L，KH2PO4添加量为15 g/L，在该条件下进行3组重复验证试验，得到发酵液中GABA的质量浓度为412.54 μg/mL，与预测值相差1.1%，这表明采用响应面分析优化得到的参数准确可靠。相比于未添加MSG，经混菌发酵后红枣汁中GABA质量浓度的138.17 μg/mL，底物优化后使GABA的产量增加。

表3 响应面试验结果Table 3 Experimental results of response surface

表4 响应面试验方差分析Table 4 Variance analysis of response surface test

2.4 乳酸菌发酵红枣汁主要成分变化

2.4.1 发酵过程中总酸和pH的变化 酸度是发酵过程的一个重要指标[21]，发酵过程中变化规律如图1所示。由图4可知，随着发酵时间的增加，LB和LP混菌发酵使总酸质量浓度不断上升，pH不断降低，这可能是由于乳酸菌不断繁殖和代谢，使发酵液中积累大量的酸；当发酵时间超过60 h之后，红枣汁中低酸环境和高浓度H+抑制了乳酸菌的生长，使乳酸菌产酸能力受到一定影响[22]。因此在发酵后期红枣汁中的总酸和pH变化不大。发酵时间为60 h时，总酸质量浓度从最初的5.81 g/L增加到20.63 g/L，相比于未优化前，总酸含量有了显著的增加。这可能是调整后的红枣汁营养物质充足，促进了乳酸菌的生长，从而提高了红枣汁中乳酸产物的积累[19,23]。

2.4.2 发酵过程中还原糖和总酚的变化 从图5中可知，随着发酵时间的延长，还原糖质量浓度在0～60 h迅速下降，60 h后逐渐趋于稳定。质量浓度下降原因是随着发酵的进行，乳酸菌在红枣汁中不断的生长和代谢消耗糖类物质，使糖含量快速的下降[24]；60 h后，红枣汁中乳酸含量增加和糖类物质减少抑制了乳酸菌的生长，使还原糖消耗速率逐渐降低；发酵时间为60 h时，还原糖质量浓度从最初的135.42 g/L降低到69.82 g/L。

图4 发酵过程中总酸和pHFig.4 Total acid and pH during fermentation

总酚质量浓度随着发酵时间的延长呈现先上升后下降的趋势。0～60 h内，总酚质量浓度不断的增加，可能是发酵过程中乳酸菌利用红枣汁中的营养物质进行生长，破坏了红枣本身的一些结构，从而使多酚物质溶出[25]；60 h时总酚质量浓度最大，从未发酵前2 279.57 mg/L增加到 3 181.64 mg/L；当超过60 h，总酚质量浓度逐渐下降，可能是在发酵的过程中，多酚被微生物代谢产生的一些酶类物质水解产生的现象[26]。

图5 发酵过程中总酚和还原糖Fig.5 Total phenol and reducing sugar during fermentation

2.4.3 发酵前后游离氨基酸质量分数的变化 氨基酸不仅是维持机体正常代谢的重要物质，而且在食品中有调节风味的作用。由表5可知，未发酵红枣汁中检测出14种氨基酸，混菌发酵后检测出16种氨基酸，异亮氨酸和丝氨酸在发酵后均被检出。其中赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸这3种必需氨基酸质量分数均有增加，非必需氨基酸中谷氨酸质量分数最高。这是由于添加5 g/L的 L-谷氨酸使其质量分数急剧上升，甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的质量分数为446.02、189.51、 20.91 mg/hg，与未发酵的红枣汁相比质量分数明显上升，且发酵后氨基酸种类也更加丰富。这说明增加的氨基酸均由乳酸菌发酵所得，同时经过发酵也使红枣汁的风味更佳[27]。

3 讨 论

3.1 底物添加量对GABA的影响

微生物主要利用柠檬酸循环(TCA)中的一个重要旁路谷氨酸脱羧酶催化底物L-谷氨酸进行脱羧反应来合成GABA[28]。当红枣汁中MSG添加量在0～8 g/L能够促进GABA的产生，这是由于MSG水解成Na+和L-谷氨酸，L-谷氨酸作为合成GABA的底物，刺激谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)从而产生 GABA[29]。如果MSG添加量过高，不仅会抑制GABA的产生，还会影响红枣汁的风味和口感，所以MSG最佳添加量为5 g/L，这与Kantachote等[8]研究结果一致。因此，乳酸菌发酵红枣汁时，MSG添加量需控制在一定5 g/L内。

表5 红枣汁发酵前后游离氨基酸质量分数Table 5 Free amino acid mass fraction in jujube juice before and after fermentation mg/hg

GABA量还受发酵液中碳氮源营养成分的影响[30]。因此需要对发酵液中碳氮源含量进行优化，以期增加红枣汁中GABA的量。添加的葡萄糖能通过TCA循环代谢为α-酮戊二酸，再经谷氨酸脱氢酶转化为谷氨酸，被GAD分解成 GABA，从而促进GABA的积累[31]。本研究结果也表明适量的碳氮源量会显著影响红枣汁 GABA的量，因此调整红枣汁中碳氮比量为最佳时，能促进GABA的产生。

3.2 优化前后对红枣汁中主要成分的影响

由于红枣汁中营养成分有限，会使乳酸菌发酵受到一定的影响。经过优化增加了红枣汁中的营养物质，更利于菌体的生长，使发酵液中总酸质量浓度较未优化前显著增加，pH较未优化前下降，同时，经过乳酸菌发酵后的红枣汁氨基酸种类和含量均有增加。

4 结 论

本研究以红枣汁为原料，利用LP和LB进行混合发酵，探究乳酸菌发酵产GABA的最佳条件，以及红枣汁发酵前后主要成分的变化。结果表明，添加5 g/L的MSG、11 g/L乳清粉、调整可溶性固形物为20%、0.4 g/L的MgSO4、 15 g/L 的KH2PO4、发酵时间为60 h时，红枣发酵液中GABA产量为412.54 μg/mL。发酵后总酸质量浓度为20.63 g/L、pH 3.23、还原糖质量浓度 69.82 g/L、总酚质量浓度3 181.64 mg/L，相比于未发酵前红枣汁中GABA、总酸、酚类物质和氨基酸质量分数明显升高，使红枣汁的品质优于发酵前。

综上所述，本研究利用乳酸菌发酵红枣汁生产含GABA的饮品，为开发富含GABA的纯天然发酵饮品提供一定的理论依据和技术指导。