不同菜心品种萌发期和苗期耐热性分析及其鉴定指标筛选

庞强强，周 曼，孙晓东，陈贻诵，蔡兴来

(海南省农业科学院 蔬菜研究所/海南省蔬菜生物学重点实验室，海口 571100)

菜心(BrassicacampestrisL. spp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)，又名菜薹，为十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种，以花薹为主要食用器官，是中国华南地区的特产蔬菜之一[1]。菜心喜温，其生长适宜温度为15～25 ℃，30 ℃以上高温植株生长就会受到阻碍[2]，导致菜薹叶片纤细，品质下降，甚至死亡。海南岛地处热带北缘，属热带季风气候，素来有“天然大温室”的美称。随着全球气候变暖，海南岛高温日数也呈现出明显增多的态势[3]，高温已成为农业生产中面临的主要问题之一。通过筛选、培育耐热菜心品种是解决上述问题的必由之路，而合理选择耐热性鉴定指标是进行耐热育种、耐热机理及高温调控缓解机制研究的基础。

作物耐热性鉴定及耐热指标筛选需要将不同指标相结合，对各个时期进行综合评价，以筛选出简单有效的耐热性鉴定指标和适宜的综合评价方法[4]。种子萌发期和苗期是植物生长发育过程中的重要时期但又是最脆弱的时期[5]。多年来，国内外学者在作物萌发期和苗期耐热性鉴定及耐热指标筛选方面开展了大量研究工作，同时提出了不同作物在不同条件下的鉴定指标和评价体系[6-7]。在菜心耐热适应机制研究上，研究者发现高温会导致菜心种子发芽势、发芽力及发芽指数降低[8]，幼苗叶片内甜菜碱、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量及抗氧化酶活性显著升高[1,9]；郭培国等[10]采用抑制差减杂交(SSH) 技术，构建了一个高温胁迫下在耐热品种中特异表达的SSH cDNA 基因文库，BLAST 分析发现99条ESTs代表81个基因可能与菜心的耐热性相关。在菜心耐热性指标筛选研究方面，李光光等[11]通过隶属函数法得到高温塑料棚采收期的菜心株高、薹叶数、单株生物总质量可用来评价菜心的耐热性，并将6个菜心材料分为3类。李荣华等[12]认为生物量和薹质量可作为评价菜心耐热性强弱的关键农艺性状指标。综合前人研究结果来看，当前的研究主要集中在高温胁迫对菜心的农艺性状指标和生理生态响应方面，而关于菜心萌发期和苗期耐热性鉴定及其耐热指标筛选的研究并不常见，至今还未建立一套高效的菜心耐热性鉴定体系和评价标准。本研究采用模拟高温胁迫法，通过对菜心不同品种萌发期种子发芽指标和苗期生长及生理指标进行测定，以各单项指标的耐热系数为衡量单项耐热能力的指标，采用主成分分析法、隶属函数法、聚类分析、关联度分析、逐步回归分析法对菜心耐热性进行鉴定和综合评价，从而筛选出耐热性强的菜心材料及易测定的与菜心种质耐热性密切相关的指标，以期为菜心耐热种质的发掘及新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菜心品种20份(表1)，试验在海南省农业科学院蔬菜研究所永发试验基地和海南省蔬菜学重点实验室进行。

表1 参试菜心品种名称及编号Table 1 Name and number of Chinese flowering cabbage cultivars in test

1.2 试验设计

1.2.1 模拟高温胁迫试验 以珍珠岩为基质进行穴盘育苗，常规栽培管理。当幼苗长至三叶一心时移至25 ℃/18 ℃(昼/夜)，12 h/12 h(昼/夜)，光照覆盖率80%，相对湿度90%的光照培养箱中预培养3 d，之后进行高温处理。为明确不同基因型菜心萌发期和苗期高温胁迫耐性的适宜筛选温度，进行预备试验，得出37 ℃/27 ℃能较好地反映不同品种耐热性的差异。因此，选取37 ℃/27 ℃作为高温胁迫处理温度。以 25 ℃/18 ℃条件下正常生长的幼苗为对照，每个处理重复3次。

1.2.2 种子发芽试验 20个菜心品种分别选取100粒优质、饱满的种子，去离子水中浸泡2 h后，在洁净、烘干的培养皿中均匀摆入已干燥的种子，盖上培养皿，分别放入不同温度的培养箱中，让其在黑暗中发芽，保持滤纸湿润，每个品种均设3次重复。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 发芽试验测定项目和方法 以胚根的长度超过种子半径视为发芽，第7天统计发芽势，第14天统计发芽率，具体计算公式如下：

发芽率(GR)=发芽终期全部正常发芽种子数/供试种子数×100%

(1)

发芽势(GP)=发芽初期正常发芽的种子数/供试种子数×100%

(2)

活力指数(VI)=发芽指数GI×幼苗生长 势S

(3)

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)

(4)

式中，Gt为在t日的发芽数，Dt为其相应的发芽日数。

1.4 数据分析与评价方法

按照公式计算植株耐热系数(γ)。

γ= 处理组测定值/对照组测定值

(5)

按照公式计算综合指标隶属函数值 [u(Xi)]。

u(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)i=1，2，3，…n

(6)

式中，u(Xi)表示第i个综合指标的隶属函数值；Xi表示第i个综合指标值；Xmin、Xmax分别表示综合指标的最小值和最大值。

(7)

式中，Wi表示第i个综合指标在所有综合指标中重要程度；Pi表示第i个综合指标的贡献率。

(8)

式中，D表示不同品种在高温胁迫下综合指标评价所得的综合耐热性评价值。

采用Microsoft Excel 2003对数据进行统计，利用SPSS 22.0进行方差和显著性检测，单因素分析采用Duncan’s法。采用皮尔逊相关系数对各单项指标进行相关性分析，用主成分分析法进行主因子分析，采用组间连接距离聚类法对各品种进行聚类分析，采用灰色关联度分析法分析各单项指标的耐热系数与参考序列的关联度，采用逐步回归分析法建立最优回归方程。

2 结果与分析

2.1 不同菜心品种各单项指标的耐热系数和相关性分析

对初级指标耐热系数进行相关性分析发现，多数生理指标间存在不同程度的相关性(表3)，其中有的指标间存在显著的相关性，如活力指数与地上部鲜质量(r=0.297，P<0.05)，可认为活力指数与地上部鲜质量提供的共同信息量为 29.7%。而有的指标间存在极显著的相关性，如发芽率与活力指数之间相关性显著(r= 0.721，P<0.01 )，可认为发芽率与活力指数提供的共同信息量为72.1%；发芽率与发芽势之间相关性显著(r=0.621，P<0.01)，可认为相发芽率与发芽势提供的共同信息量为62.1%，其余具有相关性的评价指标间也存在着不同的信息重叠。因此，用某一个鉴定指标来评价不同菜心品种的耐热性难以得到客观的结果。为了弥补用单一指标来评价耐热性的不足，在此基础上需进一步发掘能充分反映其在高温胁迫条件下的耐热性指标。

表2 不同菜心品种各单项指标的耐热系数变异分析Table 2 Variation analysis of heat resistance coefficient of every individual indicator in different Chinese flowering cabbage cultivars

2.2 不同菜心品种各鉴定指标的主成分分析

利用主成分分析法将21个单项指标换算成3个相互独立的综合指标，分别用主成分1、主成分2和主成分3表示(表4)，其贡献率分别为 66.30%、8.22%和6.36%，累计贡献率达到 80.88%，说明这3个综合指标已经包含菜心耐热性的大部分信息。根据主成分分析原则，同一指标的特征向量的最大绝对值所在的主成分即为其所属主成分。各综合指标对应的特征向量为：第1主成分(主成分1)z1=0.775GR+0.777GI+ 0.441VI+0.724GP+0.977FAW+0.911 FUW+0.890DAW+0.879DUW-0.911HDI+ 0.876Chl+0.758RA+0.169RSA-0.838SAR- 0.805HP-0.939RC-0.819MDA+0.881SS+0.933Pro+0.907SOD+0.562CAT+ 0.874POD，其中在地上部鲜质量、相对电导率、脯氨酸质量分数有较高的载荷量；第2主成分(主成分2)z2=0.564GR +0.563GI+0.752VI+ 0.372GP-0.148FAW-0.190FUW- 0.230 DAW-0.134DUW+0.022HDI-0.153Chl- 0.077RA+0.058RSA+0.018SAR+0.138HP+0.128RC+0.247MDA+0.144SS-0.207Pro+0.002SOD-0.255CAT+0.028POD，其中在活力指数、发芽率上均有较高的载荷量；第3主成分(主成分3)z3=-0.021GR-0.020GI-0.178VI+0.037GP-0.011FAW-0.029FUW- 0.285DAW+0.334DUW+ 0.227HDI- 0.170Chl+0.261RA+0.949RSA-0.086SAR-0.035HP+0.093RC+0.117MDA+0.154SS+0.004Pro-0.028SOD+0.027 CAT+0.035 POD，其中在根冠比上有较高的载荷量。

表3 不同菜心品种各单项指标的相关系数矩阵Table 3 Correlation matrix of every individual indicator in different Chinese flowering cabbage cultivars

注： * 和**分别表示P<0.05 和P<0.01 的显著水平。

Note: * and ** significant level atP<0.05 andP<0.01．

表4 各综合指标的系数及贡献率Table 4 Coefficients and proportion of comprehensive indicators

2.3 不同菜心品种耐热性综合评价

2.3.1 隶属函数分析 为进一步明确3个综合指标对菜心高温胁迫耐受性的贡献率，采用隶属函数分析法进行菜心耐热性综合评价(表5)。首先对20个品种的耐热系数进行标准化，再按公式(6)计算20个品种在3个综合指标中的隶属函数值。同一综合指标下，隶属函数值越大，表明菜心品种在这一综合指标上的耐热性越强，反之则越弱。由表5可知，不同菜心品种的所有综合指标的隶属函数值不尽相同。对于同一综合指标z1而言，品种C3的u(X1)值最大为1，说明C3菜心品种在z1这一综合指标上表现出的耐热性最强，而C15的u(X1)值最小为0，说明C15菜心品种在z1这一综合指标上表现出的耐热性最弱。对于同一综合指标z2而言，C14的u(X2)值最大为1，说明C14菜心品种在z2这一综合指标上表现出的耐高温性最强，而C17的u(X2)值最小为0，说明C17菜心品种在z2这一综合指标上表现出的耐高温性最弱。对于同一综合指标z3而言，C15的u(X3)值最大为1，说明C15菜心品种在z3这一综合指标上表现出的耐高温性最强，而C5的u(X3)值最小为0，说明C5菜心品种在z3这一综合指标上表现出的耐高温性最弱。

2.3.2 各综合指标权重和综合评价 通过公式(7)计算各综合指标在主成分贡献率中的权重，从而得出3个综合指标权重分别为0.820、0.102、0.079。根据隶属函数值和权重的计算结果，用公式(8)来量化每一品种的综合耐热性能的强弱。本研究中，D值为各品种耐热性的综合评价值，D值越大，表明材料的综合耐热性越强。由表5可知，通过对各品种的D值进行排序得出，不同菜心材料耐热性强弱顺序为C12>C9>C10>C3>C17>C4>C14>C8>C11>C19>C1>C5>C15>C18>C2>C6>C20>C13>C16>C7。

2.3.3 耐热性聚类分析 采用组间连接距离聚类法对20个菜心品种的D值进行耐热性聚类分析，建立聚类树状图。由图1可知，可将20个菜心品种分为3类，即第Ⅰ类对高温的耐受性较强，包括品种C3、C17、C4、C9、C10和C12；第Ⅱ类对高温耐受性较差，包括品种C13、C16、C7和C20；第Ⅲ类对高温的耐受性一般，包括品种C11、C19、C8、C14、C2、C6、C5、C15、C18和C1。

表5 不同菜心品种的耐热综合指标值、权重、隶属函数值、D值及综合评价Table 5 Comprehensive indicator values,index weight,membership function values,D values and comprehensive evaluation of heat tolerance in different Chinese flowering cabbage cultivars

2.3.5 逐步回归分析 为分析21个单项指标与不同菜心品种之间的耐热性关系，筛选能够客观鉴定菜心耐热性的指标，建立可用于菜心萌发期和苗期耐热性评价的数学模型，将耐热性综合评价值(D值)作为因变量，把各单项指标的耐热系数作为自变量进行逐步回归分析，建立最优回归方程：D=-0.767+0.861HDI+0.551POD+ 0.373MDA+ 0.018SS+0.112GP-0.014HP，该方程决定系数R2=0.995，F=401.96，显著性水平P= 0.000 1，统计量为2.41。由方程可知，21个单项指标中有6个指标对菜心耐热性有显著影响，分别是热害指数、POD活性、MDA质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、发芽势、H2O2质量分数。因此，在实际应用中，可有选择性地测定与D值密切相关的指标并求得耐热系数，进而利用该方程预测其他菜心品种的耐热性，从而使鉴定工作简化。

表6 不同菜心品种各单项指标的灰色关联度分析Table 6 Grey relational degree analysis of every individual indicators in different Chinese cabbage varieties

图1 不同菜心品种耐热性聚类图Fig.1 Dendrogram of clusters in different cultivars of Chinese flowering cabbage

3 讨 论

植物耐热性是由多基因控制的复杂性状[21-22]，不同指标对耐热性的反映并不一致，如果仅用单一的指标很难全面准确地反映各品种的耐热性强弱，得出结果可能具有较大偏差；而多项指标之间又存在一定的相关性，容易发生信息重叠与交叉[6,23]，本研究结果也证实这一观点。近年来，国内外学者针对不同作物类型，提出采用多个指标、多种方法相结合的方式对作物进行抗性鉴定，能更加全面地反映出耐逆性强弱，同时也筛选出多种与植物耐逆性相关的生长和生理生化指标[23-25]。本研究选用较为直观、便捷的21个指标进行测定，并将计算出的各指标耐热系数作为评价菜心单项耐热能力大小指标，以此来消除不同基因型菜心间固有的生物学和遗传学特性差异。然后采用主成分分析将21个指标的耐热系数转换为3个独立的综合指标，通过隶属函数分析法得出各菜心品种综合耐热能力(D值)，同时结合聚类分析结果，较为客观地将20个参试品种划分为耐热型、中等耐热型和不耐热型 3个不同耐热等级。最后通过回归分析，得出快速鉴别并预测菜心耐热能力的最优回归方程D= -0.767 + 0.861 HDI +0.551 POD + 0.373 MDA + 0.018 SS+ 0.112 GP - 0.014 HP，筛选出6个对菜心耐热能力具有显著影响的指标，即热害指数、POD活性、MDA质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、发芽势及H2O2质量分数，这与灰色关联度分析所显示的各指标重要程度的结果也基本一致。作物耐热性鉴定的最终结果是要划分供试种质的耐热等级，以此来判定其耐热能力。因此，在相同的高温胁迫条件下，可通过测定这6个鉴定指标，并利用回归方程来预测候选品种的耐热性强弱，该方法已在燕麦[26]、棉花[27]和花生[28]等作物的抗逆性鉴定中得到了应用。

综上所述，本试验将参试的20个菜心品种分成耐热型( 6个) 、中等耐热型( 10个)和不耐热型(4个) 3种类型。热害指数、POD活性、MDA质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、发芽势及H2O2质量分数可以作为菜心耐热性鉴定指标。