水环境中Ni2+对鲤鱼鳃和肝脏的组织损伤

陈代宇，杨 飞，陈德芳，耿 毅

(1. 四川农业大学 动物科技学院，四川温江 611130；2. 四川农业大学 动物医学院，四川温江 611130)

镍(Nickel，Ni)是水环境中常见的污染物[1]，一部分来自地质风化的自然资源，一部分来自工业废水排放、生活污水排放等人为活动[2]。水体Ni污染程度与沿岸污染源的分布密切相关，在工业集中地段及城市段的河流污染较严重，资料显示长江上游[3]、海河河口[4]、珠江下游[5]和松花江[6]表层沉积物中Ni分别达到34.52 mg/kg、48.70 mg/kg、54.10 mg/kg和99.00 mg/kg，使周边地区稻田水环境遭到Ni污染的可能性增加。虽然Ni是生物体不可缺少的微量营养素[7]，但有研究表明，过量Ni蓄积于生物体内也会具有潜在的致癌性[8]、基因毒性[9]和免疫毒性[10]等毒害作用。过量的Ni在水生生物体内富集会降低水生生物的呼吸作用、离子调节和抗氧化能力[11]。水环境中的Ni主要以卤化物、硝酸盐、硫酸盐等形式溶于水，Ni2+在水环境中普遍存在，根据已有的研究报道，Ni2+对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[12]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)幼鱼[13]、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)和大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)[14]的96 h LC50分别为0.33、0.79、3.83、3.84 mmol/L，并且可造成虹鳟[15]、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)[16]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[17]的鳃和肝脏组织损伤，而目前关于Ni2+对鲤鱼组织的急性损伤还未见报道。

鲤鱼是四川省内稻田养殖中常见的品种，养殖鲤鱼具有成本低、收益大的特点[18]，水体中Ni2+浓度为0.003、0.005、0.008 mmol/L时，会影响鲤鱼的游泳情况和呼吸频率，从而使得存活率降低[19]，加剧经济损失。但养殖水环境中Ni2+对鲤鱼的急性致死浓度和急性病理损伤机理尚不清楚，因此通过急性毒性试验明确Ni2+对鲤鱼的安全浓度是非常必要的。本研究通过Ni2+对鲤鱼的急性毒性试验，明确Ni2+对鲤鱼的安全浓度。并且在急性毒性试验的基础上，从组织病理学变化的角度初步研究水环境中Ni2+对鲤鱼鳃和肝脏的急性损伤，以期为Ni2+对鱼类的急性毒性和致病机理研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

600尾健康鲤鱼全长 (4.50 ± 0.50) cm，体质量(2.57±0.52) g，购自四川浦江养殖场。暂养在实验室(700×400×300) mm3的水族箱中，养殖水体的体积为40 L，水温(22±1)℃，pH为6.5～7.0，待鱼适应实验室环境后开始试验，试验前禁食24 h。NiSO4·6H2O为分析纯，成都市科龙试剂化工厂产品，在试验前根据所需的Ni2+浓度进行配制。

1.2 急性毒性试验

预试验确定96 h内0%和100%鲤鱼死亡的Ni2+浓度为0.55～1.25 mmol/L，设置1个对照组和7个试验组，Ni2+浓度分别为0、0.55、0.62、0.72、0.83、0.96、1.09、1.25 mmol/L。将240尾鱼随机分到对照组和各试验组中，每组30尾，水体体积为8 L，温度和pH与暂养期间一致。参照王万良等[20]、郭建波[13]的研究方法进行急性毒性试验，试验期间每24 h更换1次药液，进行 96 h的临床症状观察并记录死亡数量，根据各试验组在各时间点的死亡数，用寇氏法计算Ni2+对鲤鱼的96 h LC50[21]；并计算安全浓度(SC)，SC=96 h LC50× 0.01[2]。

1.3 鳃和肝脏的组织病理学观察

基于急性毒性试验的鲤鱼死亡情况，设置1个对照组和5个试验组，Ni2+浓度分别为0.72、0.83、0.96、1.09、1.25 mmol/L，将360尾鱼随机分到对照组和试验组中，每组30尾，每组2个重复，其他处理同急性毒性试验。对试验鱼进行连续96 h的临床症状观察，对每组濒死鱼进行剖检，并收集鳃和肝脏，固定在φ=10%的中性福尔马林溶液中。参照王国华等[22]、陈德芳[23]的方法进行组织切片和苏木素-伊红染色，通过光学显微镜观察组织病理变化。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

试验期间，对照组(0 mmol/L)的鲤鱼在整个试验期间无死亡和任何异常现象。试验组除 0.55 mmol/L组以外，其他组的鲤鱼在试验的 48 h内，都出现躁动、跳跃和鳃盖活动加快的情况，并且浓度越高躁动情况越严重，48 h后，鲤鱼表现为游动缓慢、反应呆滞；濒死鲤鱼的体表和鳃覆盖大量黏液，鱼体色变暗，鳃丝充血发红，肝脏肿大充血。

在整个试验期内，对照组和0.55 mmol/L组无鲤鱼死亡，其余试验组都有鲤鱼死亡，死亡量随Ni2+浓度升高而增多，值得注意的是，1.25 mmol/L组的鲤鱼在试验24 h内全部死亡(表1)。采用寇氏法算出96 h LC50为0.72 mmol/L，SC为0.007 2 mmol/L，表明Ni2+浓度高于 0.007 2 mmol/L的养殖水体对鲤鱼有急性毒性。

表1 Ni2+对鲤鱼的急性毒性试验Table 1 Acute toxicity experiment of Ni2+ to carp

2.2 组织病理学研究

鳃组织切片观察发现，对照组(0 mmol/L)鳃的组织结构完整，未见明显病理变化，鳃小片结构正常，呼吸上皮细胞紧贴在鳃小片表面，毛细血管结构完整，血窦内红细胞的数量、形态正常，柱状细胞结构完整(图1-A)。24 h内，高浓度试验组 (1.25 mmol/L)的鲤鱼全部死亡，鳃组织中大量的鳃小片呼吸上皮细胞坏死、脱落，毛细血管破裂，红细胞溢出血窦(图1-B)。48 h内观察到中低浓度试验组(0.72～1.09 mmol/L)鲤鱼的鳃结构出现明显变化，主要表现为鳃小片呼吸上皮水肿浮离，鳃小片融合，柱细胞结构遭到破坏(图1-C，图1-D)；72 h后，鳃的组织病理学变化主要表现为以血管反应为主的适应性病变，鳃小片内红细胞充盈，血窦扩张，多个红细胞重叠、堆积在血窦内(图1-E，图1-F)。结果表明水环境中Ni2+会对鲤鱼的鳃造成急性损伤，高浓度试验组(1.25 mmol/L)的鳃组织损伤以鳃小片呼吸上皮细胞坏死、脱落为主，中低浓度试验组(0.72～1.09 mmol/L)的鳃组织损伤以鳃小片呼吸上皮水肿浮离、上皮细胞增生为主。

肝脏组织切片观察发现，对照组(0 mmol/L)无明显病理变化，肝细胞胞浆均质淡染，肝细胞排布紧密，细胞结构完整，细胞界限清晰，细胞核呈车轮状，核仁清晰(图2-A)。试验期间，高浓度试验组(1.25 mmol/L)的鲤鱼24 h内全部死亡，肝脏组织血窦淤血，肝细胞肿大、细胞膜完整、分界清晰、细胞核固缩(图2-B)。48 h内观察到中低浓度试验组(0.72～1.09 mmol/L)的鲤鱼肝脏出现明显的组织病理变化，肝血窦、中央静脉淤血，肝细胞界限模糊、胞浆空泡化、细胞质深染，细胞核无明显变化，肝脏组织局部区域细胞坏死(图2-C，图2-D)，72 h后，肝细胞胞质深染，肝脏局部区域出现空泡融合(图2-E，图2-F)。结果表明水环境中的Ni2+会对鲤鱼的肝脏造成急性损伤，而高浓度试验组(1.25 mmol/L)以细胞核固缩为主，中低浓度试验组(0.72～1.09 mmol/L)以肝细胞空泡变性为主。

A.对照组鳃的组织结构 Gill tissue structure in the control group；B.1.25 mmol/L试验组鳃组织的病理学变化 Gill histopathology changes of 1.25 mmol/L group；C.0.72 mmol/L试验组48 h内鳃的组织病理学变化 Gill histopathology changes of 0.72 mmol/L group within 48 h；D.1.09 mmol/L试验组48 h内鳃的组织病理学变化 Gill histopathology changes of 1.09 mmol/L group within 48 h；E.0.72 mmol/L试验组72 h后鳃的组织病理学变化 Gill histopathology changes of 0.72 mmol/L group after 72 h；F.1.09 mmol/L浓度试验组72 h后鳃的组织病理学变化 Gill histopathology changes of 1.09 mmol/L group after 72 h；SL.鳃小片 Secondary gill lamella；REC.呼吸上皮细胞 Respiratory epithelial cells；PC.柱细胞 Pillar cell；ERY.红细胞 Erythrocyte；LF.鳃小片融合 Fusion of the secondary lamellae；EH.上皮细胞增生 Epithelial hyperplasia；*.鳃呼吸上皮水肿浮离 Edema of the respiratory epithelium

图1 鳃的组织病理变化(400×)
Fig.1 Histopathological changes of gill

3 讨 论

Ni是一种普遍存在于自然界的微量金属[24]，Ni也是生物体必需的微量元素[7]，但水环境中的Ni过量富集在水生生物体内会降低生物体的呼吸作用、离子调节和抗氧化能力[11]。Todorova等[19]将鲤鱼暴露在Ni2+浓度为 0.003、0.005、0.008 mmol/L的养殖水体中，最初鲤鱼表现为躁动、跳跃、快速游动等活动状况，在48 h后躁动的鱼体出现游动缓慢的现象，这些症状与本次急性毒性试验的临床症状相似。Chaudhry[25]研究发现条纹密鲈Colisafasciatus暴露在含有Ni2+的水环境中，其肝糖原和肌糖原储存降低，血糖升高，但由于Ni2+对条纹密鲈的鳃造成了急性损伤，机体缺氧应激，使条纹密鲈在试验24 h后血乳酸水平急剧升高，导致机体供能不足。本研究发现Ni2+也导致鲤鱼鳃急性损伤，导致鲤鱼缺氧应激。因此，本研究中48 h后由于机体缺氧、供能不足使鲤鱼游泳缓慢、反应呆滞，鲤鱼的鳃盖活动加快，濒死鲤鱼的体表和鳃覆盖大量黏液。Ni2+可以和鱼体表黏液结合形成蛋白复合物，吸附在鳃和体表上，阻碍鳃和体表与水环境进行氧气交换，导致鱼体缺氧[26]，因此，鲤鱼通过加快鳃盖活动从而增加鳃丝与水环境中氧气交换的频率。

A.对照组肝脏组织结构 Liver tissue structure of the control group；B.1.25 mmol/L试验组肝脏组织病理学变化 Liver histopathology changes of 1.25 mmol/L group；C.0.72 mmol/L试验组48 h内肝脏组织病理学变化 Liver histopathology changes of 0.72 mmol/L group within 48 h；D.1.09 mmol/L试验组48 h内鳃肝脏组织病理学变化 Liver histopathology changes of 1.09 mmol/L group with in 48 h；E.0.72 mmol/L试验组72 h后肝脏组织病理学变化 Liver histopathology changes of 0.72 mmol/L group after 72h；F.1.09 mmol/L试验组72 h后肝脏组织病理学变化 Liver histopathology changes of 1.09 mmol/L group after 72 h；PN.细胞核固缩 Pyknosis； BC.淤血 Blood congestion； VAC.空泡变性 Vacuolation； NEC.坏死 Necrosis；*.空泡融合 Vacuolar fusion

图2 肝组织病理学变化(400×)
Fig.2 Histopathologicalchanges of liver

鳃是鱼类呼吸、氮代谢废物的排泄器官，也是维持渗透压、离子稳态的主要部位[17,27]。鳃直接与水环境接触，其组织结构易遭到水环境中污染物的破坏，从而导致离子稳态和渗透压失衡[28]。本研究发现中低浓度试验组(0.72～1.09 mmol/L)鲤鱼的鳃小片呼吸上皮水肿浮离、细胞增生，鳃小片融合，当虹鳟[15]、鲢[16]和尼罗罗非鱼[17]暴露于含有Ni2+的水环境中也观察到相似的鳃组织损伤。已有研究报道鳃小片呼吸上皮浮离、细胞增生是鱼类对水中污染物的适应性反应，这些组织变化增加水环境污染物与鳃组织内部结构之间的扩散距离，在不破坏鳃的正常生理功能的情况下，阻挡污染物进入鳃内部，防止污染物对鳃造成损伤[29]。但鳃呼吸上皮细胞过度水肿、增生会导致鳃小片融合，阻碍血液与水环境的氧气交换，导致机体供氧不足，甚至导致鱼体窒息死亡。本研究结果表明，高浓度试验组(1.25 mmol/L)鲤鱼的鳃急性损伤主要表现为鳃小片呼吸上皮细胞坏死、脱落，毛细血管壁破裂，高浓度的Cu2+会导致斑马鱼Daniorerio鳃出现相似的急性损伤[30]。高浓度的水环境污染物导致鳃小片呼吸上皮细胞坏死、脱落，严重影响鳃的正常生理功能，使血液与水环境的氧气交换受阻。Ni2+进入鳃小片呼吸上皮细胞和毛细血管壁细胞后，诱导胞内活性氧自由基(ROS)增加，使细胞氧化应激，影响细胞的正常生理功能，诱导细胞坏死。并且ROS导致细胞膜磷脂过氧化，使细胞膜的功能和结构遭到破坏，从而导致毛细血管壁细胞破裂，红细胞外流[31]。并且鳃在维持鱼体离子平衡、渗透压平衡上起着至关重要的作用，但有研究证明鱼类暴露在重金属污染的水环境中，鳃内的Na+/k+-ATP酶的活性受到抑制，导致离子稳态失衡，引起渗透压改变[17]，进一步加快了细胞破裂的速度。

肝脏是各种新陈代谢途径的重要器官，肝脏是糖原合成与分解的主要器官，脂质沉积的潜在场所，也是体内重金属解毒的主要器官[32-33]。本研究发现鲤鱼暴露在中低浓度(0.72～ 1.09 mmol/L)Ni2+污染的水环境中，其肝脏的组织结构发生明显改变，Das等[34]用2.0 mg/100 g的NiSO4每隔1 d对鼠进行口服给药，给药10次后观察到鼠肝脏的正常结构遭到破坏，细胞出现空泡化，这与本研究观察到的结果相似。同样的，Jayaseelan等[35]分别用0.002、0.17和0.17 mmol/L镍纳米颗粒对莫桑比克罗非鱼Oreochromismossambicus进行为期14 d的处理，也观察到莫桑比克罗非鱼出现本研究中鲤鱼相似的肝脏组织病理学变化：肝细胞界限模糊，肝细胞坏死，胞浆空泡化，细胞核固缩。据研究报道，Ni2+进入细胞内，导致细胞内的活性氧自由基(ROS)增加，细胞内的ROS可以诱导脂质过氧化，导致细胞生物膜系统的功能和结构遭到破坏[31,36]，因此，本研究中观察到鲤鱼肝细胞界限模糊。同时，Ni2+和ROS与DNA和组蛋白相互作用，导致DNA损伤，并且Ni2+会导致DNA修复酶的活性降低，使受损的DNA不能及时修复[31]，使肝细胞出现细胞核固缩的现象。据报道Hg2+会导致剑尾鱼(Xiphophorushelleri)肝细胞线粒体肿胀和空泡增加，从而使肝细胞表现为空泡化[37]。本研究观察到的鲤鱼肝细胞空泡化可能也是由于Ni2+使鲤鱼肝细胞线粒体肿胀和空泡增加导致，这还有待进一步验证。此外，本研究中高浓度试验组(1.25 mmol/L)的鲤鱼在24 h内全部急性死亡。通过组织病理变化观察发现，鲤鱼在急性死亡的情况下其肝细胞损伤表现为细胞膜结构完整、细胞核固缩，这些病理变化与细胞凋亡的细胞形态相似，并且Liu等[38]研究证明Ni可以通过PI3K-Akt信号通路诱导细胞凋亡，关于Ni2+是否会导致鲤鱼肝脏细胞的凋亡有待进一步研究。