基于mt DNA COI基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定

宋鲜梅，李 敏，何云川，贺海明，王新谱

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021； 2.太原师范学院 生物系，山西晋中 030619)

近年来，宁夏蔬菜种植面积达12.7万hm2，占全区作物种植面积的10.39%，产值占种植业总产值的31.48%，蔬菜产业已成为宁夏的优势特色产业，是区域农业经济发展的重要支柱[1]。在宁夏蔬菜生产中番茄和黄瓜的种植面积较大，其中番茄栽培以保护地栽培为主，可周年生产。目前，粉虱危害已成为阻碍番茄可持续安全生产的重要生物灾害之一[2]。烟粉虱(Bemisiatabaci)和温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)是中国北方地区最常见的两种粉虱，均为番茄的重要害虫，且在宁夏都有发生报道[3-4]。随着种植面积的增加，品种的更替，目前宁夏粉虱害虫的种类及烟粉虱的生物型是否变化，亟需研究确定，进而为该类害虫的绿色防控提供科学依据。

鉴于粉虱类害虫体型微小，形态相似，极易随蔬菜、花卉、水果及其种苗的贸易活动远距离传播，且难以快速准确识别，本研究基于线粒体COI基因对宁夏各地温室内粉虱类害虫以及烟粉虱生物型进行分子鉴定，以期对粉虱类害虫的快速识别、监测、防止入侵等提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2018年6-7月在宁夏银川、永宁、贺兰山、石嘴山、吴忠、中卫、中宁、固原等地种植的番茄、黄瓜和豆角等寄主上采集到19个粉虱种群的77个样品，采集点分布如图1所示。将采集的粉虱置于盛有无水乙醇的1.5 mL离心管中，-20 ℃保存，备用。粉虱样品的具体采集信息如表1所示。

1.2 基因组DNA提取

取单头粉虱成虫于1.5 mL的离心管中，用适量的1×TE Buffer(solarbio)浸泡2次，每次15 min，用通用型柱式基因组提取试剂盒(康为世纪)进行总DNA的提取。用SimpliNano 2000分光光度计检测粉虱基因组DNA质量浓度，以 OD260/OD280值确定其是否被污染。提取的DNA -20 ℃保存，备用。

图1 宁夏粉虱采集地分布图Fig.1 Distribution of whiteflies-collecting area from Ningxia

1.3 PCR扩增及电泳检测

粉虱种类的鉴定：以77个粉虱样品基因组为模板，利用通用型引物LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-T-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC- A-3′)进行PCR扩增，目标片段长度约为710 bp。反应体系为25 μL，其中EasyTaqMix(全式金)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板300 ng左右，加ddH2O至25 μL。扩增程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，35次循环；最后72 ℃延伸 7 min。

烟粉虱生物型的鉴定：以其中的15个烟粉虱基因组为模板，利用通用型引物C1-J-2195 (5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAG-3′)和L2-N- 3014(5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATA TTA-3′)进行PCR扩增，目标片段长度约为840 bp[5]。反应体系同上。扩增程序为94 ℃预变性10 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min，35次循环；最后72 ℃延伸5 min。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增产物于4 ℃保存，备用。

PCR扩增结束后，取扩增产物5 μL，用10 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，选取与目标片段长度一致的单一片段PCR产物送北京华大基因生物技术有限公司测序。每个种群粉虱检测3～13头，共计92条序列。

1.4 序列分析

用Bioedit 7.2.5软件对公司返回的序列进行分析，根据序列峰图分别删除两端引物序列以及不稳定和不准确序列，以确保序列的高质量[6]。登陆NCBI查阅并下载相关粉虱mt DNACOI基因片段序列，用软件MEGA 7.0对所测结果与相关引用序列进行比对分析。

利用软件中的Kimura 2-parameter 模型计算种内与种间遗传距离。以获得的宁夏地区77条COI基因序列和巴西(烟粉虱)、西班牙(烟粉虱)、塞尔维亚(温室白粉虱)(登录号分别为MH186144、LN614545和MF688658)3个地区粉虱COI基因序列为靶标，黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus)COI基因序列(AB615363)为外群，用软件MEGA 7.0中邻接法(NJ法)构建系统发育树。以获得的15条Q型烟粉虱COI基因序列和在NCBI下载的相关序列[序列命名：登录号+采集地+生物型(有的无)]为靶标，同样以黑刺粉虱COI基因序列为外群，构建系统发育树[7-8]。系统发育树分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis，BP)重复检测1 000次。用DNASP 5.10软件分析群体间的核苷酸多样性(Pi)、核酸平均差异度(K)、单倍型多样性(Hd)及其相应标准偏差[9]。在Network 5.0中构建单倍型网络图[10]。

2 结果与分析

2.1 单头粉虱基因组质量浓度

分光光度计检测结果显示，所提取的单头供试粉虱基因组A260/A280为1.7～1.9，所有基因组质量浓度均大于50 ng/μL，满足试验需要。

2.2 PCR扩增、序列测定以及同源性分析

PCR扩增共计获得92条序列，分别约710 bp和840 bp，电泳检测结果见图2。经测序比对并提交到GenBank，获得基因序列登录号(表1)。92条COI基因序列与数据库中已知的靶标种相对应的COI基因片段的同源性均为99.0%～100%，表明所获得的COI基因序列准确可靠。所有烟粉虱序列比对，序列MK188909SHC2-1和MK411507MZC1-3与其他序列相比有1个碱基的区别，分别是第160位的T→C和第333位的G→A；同样所有温室白粉虱序列相比，序列MK411530YQC1-2与其他序列相比有1个碱基的区别是第12位的T→A。结果显示：宁夏银川市西夏区、中卫市沙坡头区和中宁县的粉虱为Q型烟粉虱；固原市原州区、吴忠市利通区、银川市永宁县和贺兰县等地均为温室白粉虱；而石嘴山市大武口区既有Q型烟粉虱又有温室白粉虱。

所测Q型烟粉虱与NCBI已知Q型烟粉虱COI基因序列对齐处理，比对长度为639 bp，得知宁夏Q型烟粉虱COI序列完全一致，序列中碱基A、T、C、G的数量分别为153、282、84和120，A+T的含量为68.08%。Q型烟粉虱以及外群黑刺粉虱mt DNACOI部分序列比对见图3(列出序列以外的其他序列同MK281483JMC1-4Q)。可以看出宁夏乃至中国与地中海周围国家意大利、摩洛哥、塞浦路斯等Q型烟粉虱COI序列有0～7个碱基之差，与地中海东部国家伊拉克、伊朗、阿拉伯酋长国等相差31～44个碱基，与美洲一些国家相差大于97个碱基。

M.DNA分子质量标准 DNA marker; A1-12.JMC1-1、YGYR1-1、SJZ1-1、SJZ2-1、SHC1-1、SHC2-1、ZJZ1-1、RYC1-1、MZC1-1、JQC107-5、 JQC114-1、LM94-1; B1-8.LMC141-1、LEC2-1、LEC3-1、YQC1-1、BQC1-1、CYY1-1、XPC1-1、JQC107-1

图2 引物LCO1490/HCO2198对20个粉虱COI基因序列的扩增电泳检测图
Fig.2 Amplification patterns ofCOIgene in 20 whitefly species using universal

2.3 Q型烟粉虱和温室白粉虱的种内与种间遗传距离

基于mtDNACOI基因序列，用软件MEGA 7.0中的Kimura 2-parameter模型计算种内与种间遗传距离。结果显示:Q型烟粉虱和温室白粉虱种内遗传距离均为0～0.001 6，种内平均遗传距离均为0.000 1。种间遗传距离为 0.360 7，种间遗传距离为种内遗传距离的3 607倍。

2.4 Q型烟粉虱和温室白粉虱的系统发育树分析

用于粉虱种类鉴定的77条COI基因序列和NCBI上已知且具代表性的3条COI基因序列所构建的系统发育树见图4。聚类分析结果表明，烟粉虱和温室白粉虱明显形成独立的进化分支。由所测15条Q型烟粉虱COI基因序列和在NCBI下载的相关序列构建的系统发育树(图5)可以看出，烟粉虱COI基因序列首先与黑刺粉虱COI基因序列分开，被测样本序列与FN557444ItalyQ、KF373113 XinjiangQ、DQ365874 SpainQ等36条已知Q型烟粉虱序列聚为一支，相似度为 99.45%～100%；AM944347 CyprusQ、DQ365878 IsraelQ、HQ198739 USA CaliforniaQ、AF342776 Turkey、AB297895 SyriaQ和KY441512 Costa Rica聚为一支，相似度为 99.74%～100%；KX679574Iraq、AJ510079 Pakistan、DQ133382 United Arab emirates和EU547769Iran聚为一支，相似度为 96.35%～99.61%；AY057129 Guatemala、AF340212 Argentina、DQ133370 Bolivia和KX397318 Mexico聚为一支，相似度为92.09%～98.71%；JQ305088 Bangladesh、EU760742 Cambodia、MF167658 Thailand等聚为一支，相似度为 85.94%～100%。被测样序列与AM944347 CyprusQ所在这一支序列相似度为98.89%～ 99.17%；与KX679574 Iraq所在这一支序列相似度为94.60%～95.29%；与AY057129 Guatemala所在这一支序列相似度为83.53%～85.32%；与JQ305088 Bangladesh所在这一支序列相似度为84.07%～85.18%。

Identical=. Missing=? Indel=-

图4 邻接法构建的粉虱基于COI基因序列的系统发育树Fig.4 Neighbor-joining tree based on sequences of COI gene of whitefly species

2.5 遗传多样性和单倍型网络图分析

分析的72条序列共定义22个单倍型(表2)，分别命名为Hap_1～Hap_22。单倍型的多样性为0.625。单倍型Hap_2共享个体数最多，占总个体数的61.11%，被2个及2个以上种群共享的单倍型有Hap_3、Hap_4、Hap_6和Hap_14。总群体的Pi为0.004 883，K为31.009，Pi和K的标准差分别为0.010 05和0.067。中性检验结果显示，总种群的Tajima′s D = -1.419 80，Fu’s Fs =-2.892，P>0.1，可推断Q型烟粉虱近段历史时期发生过种群扩张。用Network 5. 0构建单倍型网络图(图6)，在所有样本中较高频率单倍型位于图的左上，其余独立的单倍型则通过短支与这几种高频率的单倍型相连，从地中海地区逐渐到地中海东部(图右上)、亚洲一些国家(图左下)或美洲国家(图右下)呈现从高向低频率扩散，出现明显的进化分支，结果与系统发育树相吻合，说明Q型烟粉虱存在种群变异。

图5 邻接法构建的Q型烟粉虱基于COI基因序列的系统发育树Fig.5 Neighbor-joining tree based on sequences of COI gene of Q biotype of B.tabaci

图6 Q型烟粉虱COI基因单倍型网络中介图Fig.6 Median-joining network of haplotypes of Q biotype of B.tabaci based on COI gene

3 讨 论

本研究以宁夏19个不同地区种群的粉虱为试验材料，采用通用引物LCO1490/HCO2198和C1-J-2195/L2-N-3014 扩增COI基因序列。分子鉴定结果表明，在宁夏银川市西夏区、中卫市沙坡头区、中宁县、石嘴山市大武口区均有Q型烟粉虱的分布；在银川市永宁县和贺兰县、石嘴山市大武口区、固原市原州区、吴忠市利通区、有温室白粉虱的分布，以上地区是宁夏蔬菜产业较发达的区域。除中国北方普遍发生的温室白粉虱外，本研究明确了Q型烟粉虱在宁夏的分布情况；而近年来宁夏番茄种植区不断加重的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病也从侧面印证了Q型烟粉虱的存在。宁夏的5个地市中，固原市因海拔较高、气候冷凉，夏季温度较低，属冷凉蔬菜种植区，该区域只有温室白粉虱分布，尚未发现Q型烟粉虱，究其原因可能与Q型烟粉虱起源于热带地区，冷凉地区不适宜生存。宁夏的其他4个地市，夏季干燥且温度较高，蔬菜种植面积大，露地与保护地栽培方式并存，且大量种植的茄果类和瓜菜类蔬菜为烟粉虱提供了良好的寄主环境，利于烟粉虱的生存繁殖。

序列比对分析结果表明，宁夏不同地区的温室白粉虱和Q型烟粉虱种内遗传分化现象不明显，未形成明显的地理种群。通过系统发育树和单倍型网络图可以看出，宁夏乃至中国与地中海周围的摩洛哥、突尼斯、埃及、西班牙、希腊、意大利亚等国和非地中海地区的日本、越南、韩国、加拿大、危地马拉等国的Q型烟粉虱聚为一支或共享一个单倍型，宁夏Q型烟粉虱所在这一支很有可能是地中海的本土种群，与地中海东部的以色列、塞浦路斯、土耳其、叙利亚共和国等国的Q型烟粉虱相似度高达98.89%～99.17%，与伊拉克、伊朗、阿拉伯联合酋长国、巴基斯坦相似度达94.60%～95.29%，而与美洲国家的相似度低。本研究结果与滕希[11]关于“Q型烟粉虱在中国的发生现状及其基于mtCOI序列的系统发育分析”一文中论述的中国Q型烟粉虱的来源相一致。

马绍国等[3]报道在宁夏石嘴山市惠农区发现B型烟粉虱，而本研究中在相同地区采集的烟粉虱为Q型烟粉虱，未检测到B型烟粉虱，且最近研究[12-13]已表明中国农区烟粉虱优势生物型已经由B型转为Q型，这可能与两种不同生物型烟粉虱的竞争替代有关。很多研究表明，Q型烟粉虱比B型烟粉虱有更强的生存优势，如Q型烟粉虱发育历期比B型烟粉虱短，在低温和高温的条件下都表现出更强的生存能力，而且Q型粉虱拥有更强、更广泛、更稳定的抗性[14-16]，二者混合发生时，经过一定的时间，Q型烟粉虱会逐渐成为优势生物型。

4 结 论

本研究表明，宁夏银川市西夏区、中卫市沙坡头区和中宁县的粉虱为Q型烟粉虱；固原市原州区、吴忠市利通区、银川市永宁县和贺兰县等地均为温室白粉虱；而石嘴山市大武口区既有Q型烟粉虱又有温室白粉虱。同时发现宁夏Q型烟粉虱应源于地中海本土种群。本研究结果可对不同地区粉虱的针对性防控提供依据。