胡萝卜DcBMT基因的克隆及其在根发育过程中的表达

谭国飞， 钟秀来， 罗 庆， 王天文， 孟平红

(贵州省农业科学院 园艺研究所， 贵州 贵阳 550006)

胡萝卜(DaucuscarotaL.)为伞形科胡萝卜属冷凉性蔬菜之一，是世界十大蔬菜之一。中国胡萝卜栽培面积和产量均为世界第一，每年栽培面积约48万hm2，总产量约为1 680万t，其栽培面积和总产量分别占世界的40.1%和45.5%[1]。胡萝卜含有丰富的维生素、胡萝卜素、矿物质等营养成分，深受消费者喜欢。长期以来，胡萝卜研究主要集中在营养物质的代谢机理方面，如胡萝卜素、花青素等[2-4]。另外，胡萝卜含有的药用保健物质已被提取和利用，如提取的类胡萝卜素类(叶黄素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、玉米黄素等)物质能够改善人体视力、抗氧化、调节免疫、抗癌、延缓衰老等功效，种子提取的挥发性精油作为化妆品能够改善人体皮肤等。

前人研究表明，伞形科植物具有特殊的药用成分，如佛手酚(Bergaptol)和佛手柑内酯(Bergapten)，而佛手柑内酯是由佛手酚O-甲基转移酶(BergaptolO-Methyltransferase, BMT)催化佛手酚而来[5-7]。佛手酚和佛手柑内酯具有抗炎、抗癌、镇痛、治疗皮肤病等作用[8-10]，且这2种物质主要在伞形科植物中含量较高，如前胡、白芷、北沙参、珊瑚菜等[5-7, 9]。另外，佛手柑内酯对粘虫和菜青虫具有较强的拒食活性，能提高植物的抗虫能力[11]。胡萝卜属于伞形科植物，可能含有佛手酚和佛手柑内酯，若提高胡萝卜佛手酚和佛手柑内酯含量能够增加胡萝卜食用价值和提高胡萝卜种植的抗虫能力。为此，通过分子生物学数据，找到连接佛手酚和佛手柑内酯的催化酶对应的胡萝卜基因(DcBMT)，设计引物，并将其克隆，对得到的DcBMT基因及翻译的氨基酸序列进行生物学分析，并分析该基因在胡萝卜根中不同发育阶段的表达情况，以确定胡萝卜体内是否含有佛手酚和佛手柑内酯物质，以期为培育具有药用保健作用的胡萝卜品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

胡萝卜品种为黑田五寸，来源于贵州省农业科学院园艺研究所伞形科蔬菜课题组。2019年8月10日，将胡萝卜种子播种于贵州省农业科学院园艺所伞形科蔬菜试验地，除施用2 t/667 m2农家肥做底肥外，在胡萝卜生长过程中，不再施用任何肥料。在胡萝卜发芽(发芽率70%)后3 d、5 d、10 d、20 d、40 d、60 d和90 d取胡萝卜根，分别用锡箔纸包好后于液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱中，用于提取植物总RNA。

1.2 方法

1.2.1 胡萝卜总RNA的提取及cDNA的合成 从-80℃冰箱中取出不同发育时间段的胡萝卜根，称取2 g，于180℃烘箱烘2～3 h后冷却，并用液氮冷却研磨。使用液氮充分将其磨成细小的粉末，采用RNA Simple Total RNA Kit(Tiangen，北京)试剂盒，按说明书提取总RNA。提取不同发育阶段的胡萝卜总RNA，采用胶浓度为1.2%琼脂糖凝胶检测其完整性，采用微量分光光度计Nanodrop ND-100(Nanodrop Technologies Inc.，DE，USA)检测其浓度。

采用含有去除基因组DNA的反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit(Perfect Real-Time)(TaKaRa，大连)，将提取的总RNA按反转录试剂盒说明书反转录成cDNA。反转录的cDNA用灭菌的ddH2O稀释15倍后，于-20℃冰箱保存，用于胡萝卜基因的克隆及荧光定量PCR分析。

1.2.2 胡萝卜DcBMT基因的克隆与鉴定 胡萝卜DcBMT基因在NCBI数据库中，共有4条：XM_017394940.1、XM_017397150.1、XM_017397152.1和XM_017397150.1。其中，XM_017394940.1和XM_017397150.1序列几乎一致，相似度高达95.93%；XM_017397152.1和XM_017397150.1为部分序列，且2个序列与XM_017394940.1和XM_017397150.1序列的部分序列重合。因此，选择XM_017394940.1序列为参考序列，设计克隆引物，正向为：5′-ATGGGTGGGATCAAGACTGGTCG -3′，反向为：5′-CTACTTGGTCAATTCCATAATC

C-3′。利用该引物，以生物学重复3次的黑田五寸材料cDNA为模板，进行克隆。

PCR采用高保真PCR聚合酶ExTaq(TaKaRa，大连)克隆目的片段。克隆程序：94℃预变性4 min； 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.2 min，32个循环，于72℃延伸10 min； 4℃保存。PCR产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，使用Axygen胶回收试剂盒进行目的片段的回收。将回收的目的片段按说明书连接到pMD19-T载体(TaKaRa，大连)上。连接好的载体利用42℃热激的方法，转化到大肠杆菌DH5α，加入0.5 mL不含抗生素的LB液体中，混匀，于恒温摇床37℃摇菌恢复1 h。利用离心机离心，去除上清液后，将菌液混匀涂布于含有氨苄青霉素(浓度100 mg/L)的LB固体培养基中，37℃倒置黑暗培养12～14 h。挑取单菌落于含有氨苄青霉素(浓度100 mg/L)的LB液体培养基离心管中，37℃恒温摇床上摇菌至浑浊。利用克隆引物检测菌液是否正确，将PCR检查正确的单菌落，委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.3 胡萝卜DcBMT进化分析 将克隆到的胡萝卜DcBMT基因推导的氨基酸序列与XM_017394940.1(氨基酸登录号：XP_017250429.1)和XM_017397150.1(氨基酸登录号：XP_017252639.1)对应的氨基酸序列以及前胡BMT氨基酸序列(氨基酸登录号：ANA75355.1)进行比对，查找可翻译的阅读框，并推导成对应的氨基酸序列。获得的胡萝卜DcBMT氨基酸序列，与其他6种伞形科植物和1个睡莲科(蓝星睡莲)BMT氨基酸序列(表1)一起构建进化树。使用MEGA6的邻接方法(Neighbor Joining，NJ)构建系统进化树，Bootstrap检验值设为1 000[12]。

表1 各物种BMT蛋白信息

注：—表示BMT序列从欧芹和芹菜转录组数据库中找到，但未在NCBI上公布。

Note:— indicates that BMT sequences were found fromP.crispumandA.graveolestranscriptome data, but unpublished on NCBI.

1.2.4 荧光定量PCR分析 根据胡萝卜DcBMT测序结果，设计1对扩增长度为161 bp的荧光定量引物，正向：5′-ATAATGAAGACGGTGGTTCTA

TGG-3′，反向：5′-AGGCTCTCGGCTGTTATAAT

CAA-3′。采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司，南京)进行荧光定量PCR。荧光定量PCR为20 μL体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正向/反向引物 各0.5 μL，稀释的模板2 μL，灭菌的ddH2O7 μL。以胡萝卜ACTIN为内参基因[13]，正向：5′- CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′；反向：5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′，与目的基因一起扩增。荧光定量PCR程序：95℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60℃退火30 s，65℃延伸10 s，40个循环；72℃延伸2 min，4 ℃保存。

相对定量使用参照基因ΔCT法[14]，表达差异等于2-ΔCT，ΔCT=CT目标基因-CT actin，相对定量是基于目标基因对参考基因的表达量的比较。其中，CT值(Cycle threshold，循环阈值)表示每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CT目标基因为目标基因在反应管内的荧光信号到达设定阈值时所需要的循环数；CT actin为内参基因在反应管内的荧光信号到达设定阈值时所需要的循环数。

1.3 数据分析

使用Excel 2007进行定量数据和物质含量差异显著性分析，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜DcBMT基因的克隆

从图1看出，加cDNA模板的黑田五寸均克隆得到1条约1 000 bp的基因片段，测序获得的序列及其长度均一致，片段长度均为1 080 bp，ORF框长度均为1 080 bp。获得的该基因ORF框与公布的XM_017394940.1和XM_017397150.1基因序列ORF具有高度一致(图2)，三者一致性高达94.16%，其中克隆得到的DcBMT基因序列与登录号为XM_017394940.1序列一致性最高，为94.25%，与XM_017397150.1序列一致性最低，为91.30%。

注：M，标准分子量；1，引物克隆，未加cDNA模板；2～4，重复3次克隆。

Note:M,Marker；1,Cloning by primers without cDNA template；2～4,Cloning with three repitition.

图1胡萝卜DcBMT基因的克隆

Fig.1 The cloning ofDcBMTgene from carrot

图2黑田五寸克隆的DcBMT基因与公布的DcBMT核苷酸序列比对

Fig.2 Nucleotide sequence alignment ofDcBMTamong Kuroda and other varieties published on NCBI

2.2 胡萝卜DcBMT基因编码的氨基酸序列

从图3看出，克隆到的胡萝卜DcBMT基因推导的氨基酸序列与2个公布的胡萝卜BMT氨基酸及前胡BMT氨基酸结构一致，均含有5个保守Box结构域，3个保守基序。ZHAO等[6]研究表明，前胡BMT5个保守Box结构域均参与SAM结合，1个Box(Box Ⅳ)与底物结合，3个基序结构为催化中心。胡萝卜DcBMT基因推导的氨基酸序列含有的保守区域和基序的数量和排列顺序与ZHAO等[6]对前胡BMT的氨基酸序列排列一致，表明克隆得到的该基因为胡萝卜DcBMT基因。

注：盒标记的氨基酸(区域I-V)代表保守区域，参与SAM结合、底物结合、催化中心的残基分别用方框、线和五角星表示。

Note:Boxed amino acids (I-V regions) represent conserved regions. Residues involved in SAM binding, substratebinding, catalytic center are showed with boxes, lines and pentagram respectively.

图3黑田五寸DcBMT基因推导的氨基酸序列与公布的胡萝卜和前胡BMT氨基酸比对

Fig.3 Amino acid sequence alignment ofDcBMTgene among Kuroda,published BMT amino acids andP.praeruptorun

2.3 胡萝卜DcBMT的进化

从图4可知，所有伞形科物种均在同一个大分枝上，而非伞形科植物蓝星睡莲属于单独的分枝；胡萝卜DcBMT与白芷BMT进化最接近，为同一分枝；前胡和珊瑚菜、阿米芹与欧芹和芹菜处在同一分枝。白芷为中国传统药物之一，其对应的BMT蛋白具有催化佛手酚转化成佛手柑内酯功能[15]，前胡、珊瑚菜、阿米芹等BMT蛋白研究也具有相同功能[5-7]，表明胡萝卜DcBMT也可能具有催化佛手酚转化成佛手柑内酯功能。

Fig.4 Evolution comparison of BMT amino acid sequences among carrot and other species

2.4 胡萝卜DcBMT基因在根发育过程中的表达

从图5可知，胡萝卜DcBMT基因在胡萝卜肉质根发育各阶段均有表达。其中，在发芽后3 d和60 d表达水平最高，其次是5 d和20 d，90 d为胡萝卜开始收获时期，该基因在胡萝卜肉质根中表达水平相对较低。胡萝卜DcBMT基因在肉质根中均有表达，表明胡萝卜肉质根中可能含有佛手酚和佛手柑内酯物质，佛手酚和佛手柑内酯在胡萝卜肉质根发育过程中可能具有一定的功能。

注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: The lowercase letters indicate significance of difference at 0.05 level.

图5不同发育阶段胡萝卜肉质根DcBMT基因的相对表达水平

Fig.5 Relative expression level ofDcBMTgene in carrot fleshy root at different development stages

3 结论与讨论

研究成功克隆了胡萝卜DcBMT基因，通过其对应氨基酸序列比对和进化分析表明，该基因与已研究的前胡有相同的保守域，进化与白芷接近，表明获得的胡萝卜DcBMT基因可能具有与伞形科植物白芷、阿米芹、珊瑚菜、前胡等对应基因相同的功能[5-7, 15]。该基因在胡萝卜肉质根发育过程中均有表达，胡萝卜肉质根中可能有佛手酚及佛手柑内脂合成及物质的积累。

中国不是胡萝卜、芹菜、欧芹等伞形科物种的起源地，然而经BMT进化分析表明，胡萝卜与中国起源植物白芷，具有较近的进化关系。谭国飞等[16]对胡萝卜转录因子DcTTG1进化分析发现，胡萝卜和欧芹的转录因子DcTTG1与中国起源植物水芹和鸭儿芹具有很近的进化关系。TAN等[17]对芹菜AgFNS(Flavone synthase)进化分析表明，伞形科植物基因进化具有高度保守性。说明，伞形科植物虽在不同区域、环境下起源，但在进化过程中可能存在某些相同或者类似的进化关系，胡萝卜DcBMT基因可能与其他伞形科植物BMT基因一样，其对应的蛋白具有催化佛手酚合成佛手柑内脂的功能。

伞形科植物作为主要的蔬菜、药用和香料植物，芹菜、芫荽、水芹和胡萝卜等蔬菜作物中大部分为重要的喜凉性特色蔬菜。同时，伞形科蔬菜保健药用功能的突出特点，是深受消费者喜欢的原因之一。胡萝卜对治疗一些疾病有一定的功效，《本草纲目》记载胡萝卜具有下气补中利胸膈肠胃，安五脏，令人健食的功效。《医学纂要》记录胡萝卜具有润肾命、壮元阳、暖下部、除寒湿的功效[1]，表明中国很早就用胡萝卜作为药食用。下一步，将利用胡萝卜基因组和转录组信息，对胡萝卜佛手柑代谢途径涉及的功能基因进行预测，并利用现代分子生物技术进行基因功能验证，以及提取和分离胡萝卜中佛手柑及佛手酚等物质进行利用，为提高胡萝卜药用保健成分育种提供参考。