两性霉素B补料分批发酵工艺优化

王 昂，王耀耀，仲伟潭，张雪霞，任志红，李 敏

(微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 052165)

两性霉素B是结节性链霉菌菌株经发酵产生的次级代谢产物，是由37个碳原子构成的多烯大环内酯类抗生素[1]。临床用于治疗深部真菌如白色念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌等引起的全身性感染[2]。两性霉素B的生物合成途径为PKSI，包括活化前体(乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)的生成、内酯环的形成(多聚乙酰途径)和氨基糖的形成，其中，内酯环的形成是限制性因素。内酯环的形成是以乙酸为起始单位、丙二酸为延续单位，通过聚酮体途径缩合而成。两性霉素B生物合成的重要前体物质是短链脂肪酸，而由菌体自身代谢产生的脂肪酸不易被菌体的生物合成利用，因此需要添加外源性短链脂肪酸类前体物质[3-6]。为大幅提高产两性霉素B菌株的发酵产抗水平，作者对添加外源性短链脂肪酸类前体物质的两性霉素B补料分批发酵工艺进行优化，并在生产罐上进行工艺验证[7-8]。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

结节性链霉菌，由华北制药集团新药研究开发有限责任公司菌保中心提供。

乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、乙醇、正丙醇、正丁醇等均为试剂级，天津永大试剂公司；玉米淀粉、葡萄糖、热榨黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆、氯化钠、碳酸钙、磷酸二氢钾等均为工业级。

摇床培养箱，高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，超净工作台，台式离心机，光学显微镜，pH计，15 L、50 L全自动发酵罐(上海国强生物公司)，15 t两性霉素B生产罐。

1.2 培养基

种子培养基(g·L-1)：玉米淀粉 20，葡萄糖 10，热榨黄豆饼粉 15，酵母粉 7.5，玉米浆 5，氯化钠 1.5，碳酸钙 4，其余为自来水。pH值7.0～7.5,121 ℃灭菌30 min。

发酵培养基(g·L-1)：玉米淀粉 30，葡萄糖 30，热榨黄豆饼粉 20，酵母粉 10，玉米浆 8，磷酸二氢钾 0.5，氯化钠 1.5，碳酸钙 5，其余为自来水。pH值7.0～7.5,121 ℃灭菌30 min。

1.3 补料分批发酵工艺优化

1.3.1 生长曲线的测定

将结节性链霉菌的斜面培养菌接种于种子培养基中，28 ℃下经摇瓶(48 h)及种子罐(48 h)培养得到种子液。按10%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的50 L发酵罐中培养6～7 d，期间每8 h取样测定菌体量，绘制生长曲线。

菌体量测定：将发酵液摇匀，取10 mL，于10 000 r·min-1离心10～20 min，得到菌丝体。以菌丝体体积占发酵液体积的百分比作为菌体量。

工艺参数：培养温度28 ℃，搅拌转速300 r·min-1，罐压0.04 MPa，消前pH值碱调7.0～7.5，初始体积30 L。

1.3.2 接种量的优化

分别按5%、10%、15%、20%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的50 L发酵罐中培养6～7 d，研究接种量对菌株发酵产抗水平的影响。

工艺参数：培养温度28 ℃，搅拌转速300 r·min-1，罐压0.04 MPa，消前pH值碱调7.0～7.5，初始体积30 L。

1.3.3 培养温度的优化

按10%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的50 L发酵罐中，分别在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃下培养6～7 d，研究培养温度对菌株发酵产抗水平的影响。

工艺参数：搅拌转速300 r·min-1，罐压0.04 MPa，消前pH值碱调7.0～7.5，初始体积30 L。

1.3.4 前体物质的优化

根据两性霉素B的生物合成原理，选取不同的外源性短链脂肪酸及其盐类物质乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、乙醇、正丙醇、正丁醇作为前体物质。按10%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的50 L发酵罐中，在发酵培养24 h时，分别一次性补入2 g·L-1(以发酵液总量计，下同)的乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、乙醇、正丙醇、正丁醇，继续培养至发酵结束，研究前体物质对菌株发酵产抗水平的影响。

工艺参数：培养温度28 ℃，搅拌转速300 r·min-1，罐压0.04 MPa，消前pH值碱调7.0～7.5，初始体积30 L。

1.3.5 前体物质添加时机的优化

按10%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的50 L发酵罐中，分别在培养24 h、48 h、56 h、72 h时，一次性补入2 g·L-1的丙酸钠，继续培养至发酵结束，研究前体物质添加时机对菌株发酵产抗水平的影响。

工艺参数：培养温度28 ℃，搅拌转速300 r·min-1，罐压0.04 MPa，消前pH值碱调7.0～7.5，初始体积30 L。

1.3.6 前体物质添加量的优化

按10%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的50 L发酵罐中，在培养24 h时，分别一次性补入1 g·L-1、2 g·L-1、3 g·L-1、4 g·L-1的丙酸钠，继续培养至发酵结束，研究前体物质添加量对菌株发酵产抗水平的影响。

1.4 生产罐补料分批发酵工艺验证

在15 t两性霉素B生产罐中进行两性霉素B补料分批发酵工艺的生产验证。实验采取三级发酵，先将培养好的母瓶种子液按1%的接种量接种于一级种子罐中，培养48 h后得到一级种子液；再将一级种子液按10%的接种量接种于二级种子罐中，培养24 h后得到二级种子液；接着将二级种子液按10%的接种量接种于发酵罐中，培养24 h时一次性补入2 g·L-1的丙酸钠，继续培养至发酵结束，验证添加丙酸钠的补料分批发酵工艺对菌株发酵产抗水平的影响。

工艺参数：培养温度28 ℃，搅拌功率50 Hz，罐压0.04 MPa，消前pH值碱调7.0～7.5，发酵液初始量10 t。

2 结果与讨论

2.1 补料分批发酵工艺

2.1.1 生长曲线

了解菌株的生长代谢情况，有助于更好开展发酵工艺的研究，合理把握移种时机、补料时机等关键工艺参数。产两性霉素B菌株的生长曲线如图1所示。

图1 产两性霉素B菌株的生长曲线

由图1可知，前24 h是产两性霉素B菌株的生长适应期，此时菌株生长缓慢；24 h后菌株进入对数生长期，菌体量快速增加；56 h后菌体量基本稳定，菌株生长代谢达到了动态平衡，进入以次级代谢为主的产物合成阶段，开始大量生物合成两性霉素B。

2.1.2 接种量及培养温度

接种量及培养温度对菌株发酵产抗水平的影响见表1。

由表1可知：(1)当接种量为5%时，菌株生长代谢慢，中后期产抗水平较低，放罐效价仅6 718 μg·mL-1；当接种量为10%～20%时，菌株生长代谢快，发酵产抗水平稳定，平均放罐效价达7 599 μg·mL-1。(2)当培养温度为24 ℃时，菌株发酵产抗水平较低，放罐效价仅6 856 μg·mL-1；当培养温度为26～30 ℃时，菌株的发酵产抗水平比较稳定，平均放罐效价达7 613 μg·mL-1。因此，确定两性霉素B补料分批发酵工艺的最适接种量为10%～20%、最适培养温度为26～30 ℃。

2.1.3 前体物质

外源性短链脂肪酸类前体物质对菌株发酵产抗水平的影响见表2。

表1 接种量及培养温度对菌株发酵产抗水平的影响

Tab.1 Effect of inoculation amount and culture temperature on the level of fermentation and antibiotic-production of strains

批号接种量%培养温度℃最大菌体量%放罐效价μg·mL-1周期d50L01528266718750L021028357692750L031528387898650L042028377206650L051024316856750L061026387367750L071028397929650L0810303775436

表2 外源性短链脂肪酸类前体物质对菌株发酵产抗水平的影响

Tab.2 Effect of exogenous short-chain fatty acids on fermentation and antibiotic-production of strains

批号前体物质添加时机h添加量g·L-1添加总量g放罐效价μg·mL-1周期d50L09乙酸钠242608422750L10丙酸钠2426010697750L11丁酸钠242609132750L12乙醇242607747750L13正丙醇2426010106750L14正丁醇2426083777

由表2可知，添加外源性短链脂肪酸类前体物质后，菌株发酵产抗水平均有所提高，其中，添加丙酸钠和正丙醇的效果最好，放罐效价分别达10 697 μg·mL-1和10 106 μg·mL-1。由于丙酸钠是固体且不易燃易爆，因此，选择丙酸钠作为两性霉素B补料分批发酵工艺添加的最适前体物质。

2.1.4 丙酸钠添加时机及添加量

丙酸钠添加时机及添加量对菌株发酵产抗水平的影响见表3。

由表3可知：(1)在菌株对数生长期即发酵24～56 h时添加丙酸钠，放罐效价较高，平均值为10 609 μg·mL-1；发酵72 h时添加丙酸钠，放罐效价仅9 965 μg·mL-1。这表明，在结节性链霉菌开始次级代谢合成两性霉素B时，即发酵24～56 h时，及时加入前体物质效果更好。(2)当丙酸钠添加量为1 g·L-1时，由于添加量不足，导致菌株发酵产抗水平不高，放罐效价仅为9 879 μg·mL-1；当丙酸钠添加量增至2～4 g·L-1时，放罐效价较高，平均值为10 961μg·mL-1。因此，确定前体物质丙酸钠的最适添加时机为发酵24～56 h,最适添加量为2～4 g·L-1。

表3 丙酸钠添加时机及添加量对菌株发酵产抗水平的影响

Tab.3 Effect of adding time and adding amount of sodium propionate on fermentation and antibiotic-production of strains

批号添加时机h添加量g·L-1添加总量g放罐效价μg·mL-1周期d50L152426011044750L164826010506650L175626010277650L18722609965750L19241309879750L202426010747650L212439011384650L22244120107526

2.2 生产罐补料分批发酵工艺验证(表4)

表4 生产罐补料分批发酵工艺验证

Tab.4 Verification of fed-batch fermentation process in production tank

批号添加时机h添加量g·L-1添加总量kg放罐效价μg·mL-1周期d15t012422010945615t024844010776615t035633011209615t04---78726

由表4可知，采用添加丙酸钠的补料分批发酵工艺生产两性霉素B，15t01～15t03连续3批平均放罐效价达10 977 μg·mL-1、最高放罐效价达11 209 μg·mL-1，与采用未添加丙酸钠的发酵工艺15t04罐批相比，放罐效价提高了39.4%。这表明，添加丙酸钠的补料分批发酵工艺能大幅提高产两性霉素B菌株的发酵产抗水平，并在生产罐上实现两性霉素B的高产、稳产。

3 结论

内酯环的形成是两性霉素B生物合成的主要限制性因素，而添加外源性短链脂肪酸对内酯环的形成至关重要。通过对外源性短链脂肪酸类前体物质及其添加时机、添加量等的研究，优化了两性霉素B补料分批发酵工艺，即在产两性霉素B菌株发酵培养24～56 h左右，一次性补入2～4 g·L-1(以发酵液总量计)的丙酸钠。该工艺在15 t生产罐上连续3批平均放罐效价达10 977 μg·mL-1，与采用原发酵工艺的生产罐批相比，放罐效价提高了39.4%。采用添加外源性短链脂肪酸类前体物质补料分批发酵工艺解决了两性霉素B生物合成途径中内酯环形成的关键性因素，大幅提高了两性霉素B的生物合成量，达到了高产两性霉素B的目的。