microRNA-21靶向调控Wnt2基因对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响

王泽鑫， 关利君， 李建明， 王志超， 薛梦若， 秦孝军

内蒙古医科大学附属医院 介入放射科， 呼和浩特 010050

肝癌为目前全球范围内最为常见的恶性肿瘤之一，每年约有60万人死于肝癌，近10年来，随着现代诊断技术以及外科手术的不断发展和进步，肝癌的临床诊断和外科手术治疗已经取得了长足的进步[1]。但肝癌发病较为隐匿，患者早期临床症状无特异性，大部分患者临床确诊时已经处于疾病中晚期，失去了手术治疗的机会，患者5年生存率较低[2-3]。研究[4]表明，microRNA-21(miR-21)与肝癌的发生发展、侵袭和转移密切相关，但miR-21对肝癌的具体调控机制尚不明确。Wnt信号通路具有明显的促癌作用，与多种恶性肿瘤的发生发展有关，而Wnt2是Wnt信号通路中一种重要的信号转导因子，研究[5]证实，在恶性肿瘤细胞中Wnt2蛋白高表达，可促进肿瘤细胞的增殖。miR-21是否通过Wnt信号通路影响肝癌细胞的增殖和转移，目前尚无相关报道。本研究拟探讨miR-21靶向调控Wnt2基因对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 胚肾细胞株HEK293、肝癌细胞株HepG2以及正常肝细胞株LO2均购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)，青霉素-链霉素混合溶液(美国Hyclone公司)，澳洲胎牛血清(美国Thermo公司)，0.25%胰蛋白酶(美国Thermo公司)，miR-21抑制剂及其阴性对照(上海吉码生物科技有限公司)，LipofectaminTM 2000(美国Invitrogen公司)，质粒提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，兔抗人Wnt2多克隆抗体(武汉中美科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，HRP标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，四甲基氮唑盐(MTT，美国Sigma公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR法检测细胞miR-21表达 使用Trizol提取HepG2细胞以及LO2细胞中总RNA，加入Trizol裂解后使用氯仿/异丙醇处理，收集白色RNA沉淀；75%乙醇洗涤，离心后弃取上清。晾干后采用DEPC水溶解，合成cDNA，并进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：95 ℃变性30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s)35个循环。以U6作为内参，采用2-△△Ct方法表示miR-21相对表达量。操作严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.3.2 细胞转染 转染前1天，将对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板内(1×105/孔)，待细胞融合度达到60%～70%时，换为无血清的培养基，采用Lipofectamine脂质体法将miR-21抑制剂及阴性对照转染至HepG2细胞，分别作为抑制剂组及对照组。转染48 h后，采用荧光定量PCR检测抑制剂组与对照组miR-21表达水平，miR-21检测方法参照1.3.1，以评价转染效果。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖 转染48 h后消化细胞，接种至96孔板内进行细胞培养，培养24、48、72 h，每孔分别加入5 μg/μl MTT溶液，继续培养4 h后加入DMSO，震荡10 min，检测酶标仪490 nm下各孔吸光值，设空白对照判断各孔细胞增殖情况，每组实验重复3次。

1.3.4 流式细胞技术检测细胞凋亡 将HepG2细胞接种于6孔板内转染，转染48 h后，消化收集细胞，采用流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况，参照Annein V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒使用说明书进行操作，染色15 min后上机检测各组细胞凋亡率，每组实验重复3次。

1.3.5 Transwell实验检测细胞迁移能力 按照上述步骤转染细胞48 h后，常规洗涤、消化，离心5 min(1000 r/min)，收集细胞后使用无血清培养基将细胞密度调整为1×106个/ml，取150 μl将其接种于Transwell小室的上室，然后使用含10%胎牛血清的培养基600 μl接种于下室内，培养12 h后，将上室内的细胞使用棉签擦去，95%甲醇固定10 min，PBS洗涤，结晶紫染色30 min，置于倒置显微镜下观察细胞迁移情况。

1.3.6 Western Blot检测蛋白表达 转染48 h后向每孔细胞内加入200 μl蛋白裂解液，冰上裂解30 min后将其转入EP管内，离心10 min(12 000 r/min)，取上清并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。每组取等量的蛋白样品→SDS-PAGE凝胶电泳→转膜→5%脱脂奶粉室温封闭→Wnt2一抗封闭过夜(4 ℃)→室温下孵育二抗1 h→ECL化学发光法显色→凝胶成像仪观察，Wnt2蛋白相对表达量以目标条带与内参GAPDH的光密度值表示。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验 构建基因A 3′UTR的双荧光报告质粒，分别在HepG2细胞及HEK293细胞中按照双荧光素酶检测试剂盒说明书进行双荧光报告，使用miR-21抑制剂及其阴性对照转染，以验证miR-21与Wnt2基因的关系。各组相对荧光强度以萤火虫荧光素酶强度/海肾荧光强度比值表示。

2 结果

2.1 转染miR-21抑制剂对HepG2细胞miR-21表达的影响 HepG2细胞miR-21相对表达水平(1.978±0.035)明显高于LO2细胞(1.586±0.022)，差异有统计学意义(t=16.424,P<0.05)。转染miR-21抑制剂后，抑制剂组miR-21相对表达水平(0.857±0.017)较对照组显著降低(1.684±0.039)，差异有统计学意义(t=33.669,P<0.05)。

2.2 转染miR-21抑制剂对HepG2细胞增殖、迁移和凋亡的影响 抑制剂组HepG2细胞增殖能力较对照组显著降低(P值均<0.05)(表1)。

抑制剂组穿过Tranwell小室的细胞数(83.72±15.06)显著低于对照组(147.85±20.64)，差异有统计学意义(t=4.347,P<0.05)。抑制剂组细胞凋亡率(25.67%±3.95%)明显高于对照组(10.27%±2.14%)，差异有统计学意义(t=5.937,P<0.05)(图1)。

表1 转染miR-21抑制剂对HepG2细胞增殖的影响

图1转染miR-21抑制剂HepG2细胞凋亡情况

2.3 转染miR-21抑制剂对HepG2细胞Wnt2表达的影响 抑制剂组HepG2细胞Wnt2相对表达水平(0.862±0.127)明显低于对照组(1.306±0.218)，差异有统计学意义(t=3.048,P<0.05)(图2)。

2.4 miR-21对Wnt2的靶向调控作用验证 TargetScan软件发现Wnt2可能是miR-21的潜在靶点，miR-21抑制剂可显著抑制野生型Wnt2-3′ UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性(0.972±0.102 vs 0.612±0.092，t=4.219，P<0.001)，而对突变型Wnt2-3′ UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无明显影响(0.982±0.093 vs 0.911±0.128，t=0.972，P>0.05)。

图2 Wnt2蛋白表达的电泳图

3 讨论

microRNA是近年来发现的一类内源性小分子非编码单链RNA，约18～25个核苷酸长度，具有高度保守性[6-7]。microRNA可通过Watson-Crick碱基互补匹配原则对靶mRNA进行降解或抑制翻译来调控蛋白的表达情况[8]。学者[9-10]预测，人类基因中大约有1000个microRNA参与机体30%的蛋白编码基因，在细胞生长、发育、分化以及繁殖等多个方面均发挥着重要作用。越来越多的研究[11-13]证实，miR-21作为一种新的原癌基因，在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。

miR-21位于17号染色体短臂FRA17B脆性区域上，研究证明miR-21在多种肿瘤中表达显著升高，参与癌症相关基因的表达。肝癌作为世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，由于诊断和治疗困难，患者总体预后较差[14]。研究[15]显示，microRNA参与癌细胞免疫逃逸、肿瘤转移以及肿瘤血管的生成过程。临床研究[16]显示，在肝癌组织中miR-21明显升高，并与肝癌患者临床病理特征具有密切联系。本研究结果显示，HepG2肝癌细胞miR-21相对表达水平明显高于正常肝细胞；而转染miR-21抑制剂后，抑制剂组HepG2细胞与对照组比较，miR-21相对表达水平明显降低，表明miR-21在肝癌细胞中呈高表达状态，与学者报道结果[17]相似。miR-21可能是肝癌促癌基因之一，其高表达与肿瘤发生、发展有关。本研究显示，抑制剂组的HepG2细胞增殖、迁移能力明显低于对照组，而细胞凋亡率则明显高于对照组，表明miR-21表达受到抑制后，可有效抑制肝癌细胞的增殖和迁移，同时促进肝癌细胞的凋亡，进一步提示了miR-21与肝癌细胞增殖、迁移等恶性行为有关，与临床报道结果[18]相一致。

Wnt是一种分泌性糖蛋白，相对分子质量约为40 000，在多种组织中均有表达，当细胞外界因素发生变化时，可导致Wnt过度激活，进而发生失调导致机体发育异常甚至形成肿瘤[19-20]。Wnt信号通路在肝癌、胃癌、结直肠癌以及胰腺癌等多种恶性肿瘤中均有一定的促进癌细胞增殖、生长以及转移的作用[21]。Wnt2作为Wnt信号通路中的一种重要分子，研究[22]显示，Wnt2的大量分泌可激活Wnt2-β连环蛋白信号通路，最终促进癌细胞生长，且Wnt2表达与恶性肿瘤侵袭潜能、肿瘤分期及临床分级呈正相关关系。本研究结果显示，抑制剂组HepG2细胞Wnt2相对表达水平明显低于对照组，提示miR-21表达受到抑制后，细胞中Wnt2蛋白表达明显降低，从而可抑制Wnt信号通路的过度激活。采用双荧光素酶报告基因实验进一步证实，Wnt2是miR-21的潜在靶基因，并且miR-21对Wnt2表达存在显著调控作用，表明在肝癌中miR-21可能扮演促癌的microRNA角色。miR-21在肝癌中异常高表达促进Wnt2蛋白的表达，导致Wnt信号通路的激活，促进肿瘤细胞增殖生长以及恶性侵袭的潜能；而抑制miR-21表达，有助于促进肝癌细胞的凋亡以及增殖抑制。miR-21有望成为肝癌治疗的潜在靶点之一[23-24]。

综上所述，抑制miR-21表达可有效抑制HepG2细胞增殖和迁移，促进HepG2细胞凋亡，并抑制Wnt信号通路的过度激活，可能成为肝癌治疗的潜在靶基因之一，值得进一步深入研究分析。