PITX2 启动子甲基化及其与膀胱癌临床病理的关系

王银蕾，杨 瀚，高 杰，王玉杰，沈 冲，吴周亮，田大伟，胡海龙

（1.天津医科大学第二医院泌尿外科，天津300211；2.天津医科大学第二医院中心实验室，天津300211)

膀胱癌近些年发病率逐渐增高，排在全球癌症发病率的第9 位[1]。它的发生率和死亡率在我国泌尿系统癌症致死率中长期站于首位，癌症的根本挑战之一是检测癌症进展过程中基因的变化和导致这些变化的调节因子。目前已知异常表观遗传修饰在基因表达的改变中起关键作用，可诱导肿瘤的形成。特异性基因中启动子区域的异常甲基化作为表观遗传学中重要一项，是癌症形成和发展的关键。

PITX2 属于Paired-Bicoied 同型盒蛋白家族,并与PITX1 和PITX3 构成PITX 亚家族。所属基因位于人4 号染色体。这种蛋白作为一个转录因子[2-3]，调节胶原赖氨酰羟化酶基因的表达。其蛋白质包含两个结构域:2 型同型盒结构域（homeobox_2）和

OAR 结构域。同型盒是一种包含60 个氨基酸残基的蛋白质结构域,这种结构域在包括脊椎动物在内的各物种中都极为保守,可通过其“螺旋-旋转-螺旋”（helix-turn-helix，HTH）结构与特异性的DNA位点结合，包含这种结构域的蛋白质大部分是转录因子,并在个体发育过程中间发挥着重要作用。在正常组织中PITX2 通过调节cyclin D2[4]，cyclin D1[5]和c-myc[5]表达参与了眼睛，牙齿和腹部器官的发育，所属基因突变会导致Axenfeld-Rieger 综合征（ARS）、Peters 综合征、法洛四联症以及心室间隔缺损等先天性心脏病[6-8]。PITX2 启动子基因序列，可见聚集的回文型CpG（也称为CpG 岛）[9-10]。CpG 岛的大小范围为0.5 至5 kb，G：C 含量至少为55%，CpG至GpC 频率至少为0.65：10，CpG 岛与约50%的哺乳动物基因相关，大部分位于基因的启动子和第一外显子区域，尽管偶尔也发现它们在3′末端[11]。正常的成年健康组织中，CpG 岛几乎不是甲基化的，但在癌症中呈现不同程度的甲基化[12]。PITX2 启动子区域的高CpG 岛增加其高甲基化的概率cgtccactaa gggcggctgg aggctgggga gtcccggcga cggcggcggg ggcatccgtg gattaggatg tggattgcag gacagacctt tgtttggtca cattcgcgac agggattggg ggaagggtcg tcctccttcg agatcacgct ggatttttat agactcgcct taaaagggct cactcttcac agggttaatt tatacggctt tcgaggaata ttaggacttt taagacgctg…aatcggtatt agcggaatga agactttggg gccttggaaa tttttaaaga ggtttacttt tttttttttt ttttaataaa acaaaacccg aggataggcc aaagataccg agagaagaaa aggtgcctgc tagtaacagg tgagggatgg aagggggtgg cggggagaaa gcccccagac ggcggatcgt ctgcgcgggg ttcctgcccc aggcctggcg aacctctgag cgctcaagga gcacggcggc agtgcgctga ggccagtgag gcctgggcgc ctccgggccc aacctcgagc tcgccatttt tgaacccaag cggggaaggt…

1 材料与方法

1.1 人群选择 2010-2018 年在我院行全膀胱切除术33 例患者，取膀胱癌组织和癌旁组织(距离肿瘤边缘>5 cm)。根据WHO 2016 膀胱尿路上皮癌恶性程度分级系统将肿瘤的组织学亚型分类[13]。上述参加者已采取书面知情同意书，并且使用这些临床样本已获天津医科大学第二医院机构审查委员会的审批（伦理编号KY2018K083）。

1.2 细胞系选择 永生化膀胱上皮细胞系（SVHUC-1）和3 种膀胱癌细胞系（EJ、HTB-9、低度恶性）、（T24、高度恶性），均由天津医科大学第二医院中心实验室提供。所有细胞系均在含有10%胎牛血清（Gibico）青霉素-链霉素双抗（Gibico）、RPMI1640培养基（Gibico）/F12K（Gibico）（SV-HUC-1 基础培养基）的25 cm2或75 cm2细胞培养瓶中培养，并在37 ℃，5%CO2恒温培养箱中孵育。

1.3 RNA 提取、逆转录和PITX2 差异表达检测 使用TRIzon（CWBIO,CW0580S）法提取组织、细胞RNA，然后使用逆转录试剂盒（HiFiScript cDNA Synthesis Kit CWBIO）合成cDNA。用于QRT-PCR 测定的引物如下：正向：5′-GATCGTTAGTCGCGTAGT CG-3′和反向：5′-TCCAACTTTCTCGCTCGAT-3′。（引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）RT-PCR 参数为94 ℃，5 min；35 个循环的95 ℃，30 s，58 ℃，30 s；并在72 ℃延伸10 min。qPCRmix（2×lightcycler 480 SYBR Green I Master,Roche）荧光定量PCR 仪（Life Technologies，ABI7900）。

1.4 免疫组化检测PITX2 蛋白差异表达 细胞蛋白提取：75 cm2培养瓶细胞铺满80%，按说明书加入RIPA 和PMSF（CWBIO，CW2334S），冰上孵育间断摇匀30 min，4 ℃离心机离心机离心15 min。取上清；组织蛋白提取：液氮研磨黄豆大小组织，加入RIPA 和PMSF，相同方法。提取的蛋白95 ℃变性保存。

1.5 甲基化DNA 检测 应用甲基化DNA 检测试剂盒（CWBIO，CW2140M） 纯化在2.3 中提取的cDNA，再进行甲基化的PCR 检测。引物和方法同上。用于检测33 例膀胱癌组织的PITX2 甲基化程度。

1.6 统计学分析 所有数据分析均使用SPSS 22.0软件。GraphPad Prism 5.0 用于绘制所有图形。配对学生t检验应用于永生化膀胱上皮细胞系（SV-HUC）和3 种膀胱癌细胞系的甲基化程度的比较，而单因素方差分析用于多个病理亚组之间的比较。通过χ2检验检查PITX2 表达与患者临床特征的关系。构建受试者工作特征（ROC）曲线以评估PITX2 启动子甲基化对肿瘤侵袭的诊断准确性。使用Kaplan-Meier方法分析术后存活率，并使用对数秩检验评估存活曲线之间差异的显着性水平。P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 PITX2 差异表达 检测PITX2 在SV-HUC-1和3 种膀胱癌细胞系的差异表达情况（图1A），PITX2 在33 例膀胱癌组织与癌旁组织的差异表达（图1B）。

2.2 蛋白水平上检测PITX2 差异表达 免疫组化实验检测蛋白水平上PITX2 的差异表达，膀胱癌细胞系PITX2 表达明显高于永生化膀胱上皮细胞系（图2A），癌组织的表达明显高于癌旁正常组织（图2B）。

2.3 PITX2 启动子甲基化差异检测 在永生化细胞系和3 种膀胱癌细胞系中检测PITX2 启动子甲基化的差异表达（图3A），同时在33 例膀胱癌组织和癌旁组织中验证PITX2 启动子甲基化的差异表达（P＜0.000 1，图3B）。及癌组织中PITX2 甲基化程度与患者临床参数的相关性（表1）。

2.4 PITX2 启动子甲基化与膀胱癌临床病理因素的相关性 33 例癌组织中PITX2 甲基化程度与患者临床参数的相关性（表1）。

图1 PITX2 差异表达Fig 1 PITX2 differential expression

图2 蛋白水平上检测PITX2 差异表达Fig 2 Detection of differential expression of PITX2 at protein level

图3 PITX2 启动子甲基化差异检测Fig 3 PITX2 promoter methylation difference detection

表1 PITX2 启动子甲基化与膀胱癌临床病理因素的相关性Tab 1 Correlation between PITX2 promoter methylation and clinicopathological factors of bladder cancer

为了评估PITX2 启动子甲基化对肿瘤侵袭（T2-T4 膀胱癌）的诊断价值，绘制了ROC 曲线。ROC 曲线下面积（AUC）为0.867，敏感性和特异性分别为0.653 和0.726（图4A），表明PITX2 启动子甲基化在肿瘤侵袭诊断中的适度准确性。

PITX2 启动子甲基化表达与患者存活率的相关性探讨了PITX2 启动子甲基化表达水平（高与低）与膀胱癌患者总体存活率的相关性。 Kaplan-Meier曲线显示，与低PITX2 甲基化表达的肿瘤相比，高PITX2 甲基化表达的肿瘤与较短的总体存活相关。在这项研究中，中位随访时间为24 个月。高表达组的中位总生存时间为22.5 个月，而低表达组为34个月（图4B，P=0.001 1）。

图4 PITX2 启动子甲基化在预测肿瘤侵袭性和预后上的作用Fig 4 The role of PITX2 promoter methylation in predicting tumor invasion and prognosis

3 讨论

基因启动子甲基化在预测癌症发生和预后中发挥作用。如非小细胞肺癌[14]，乳腺癌[15]和前列腺癌[16]的研究所示，与肺腺癌相比，SHOX2 和PITX2 的DNA 甲基化在肺鳞状细胞癌中显着更高，并且与吸烟史有很大相关性，能够将SHOX2 和PITX2 的DNA 甲基化描述为用于检测肺癌的生物标志物。乳腺癌中，RASSF1A 和PITX2 的CpG 岛启动子的高甲基化可能在乳腺癌发病机制的早期阶段起重要作用，并且与年龄增加（P＜0.05），肿瘤分级（P＜0.000 1）和分期（P＜0.000 1）显着相关。在前列腺癌中，PITX2甲基化是生化复发的最强预测因子，为根治性前列腺切除术治疗患者，尤其是中度风险患者（Gleason 7）提供预后信息。肿瘤中PITX2 甲基化程度大于中位数的患者在术后8 年内发生生化复发的可能性是甲基化程度低于平均水平的患者的4 倍。这些研究都说明PITX2 启动子甲基化能够成为肿瘤诊断以及预后预测的可靠指标。本研究主要方向是其在膀胱癌中PITX2 启动子甲基化的诊断和预测价值。

启动子区域高CpG 岛是甲基化的基础，PITX2启动子区域CpG 岛分布明显高于其他基因，Salem等[17]分子机制研究显示，位于转录单位不同区域的CpG 岛的定量扫描提示可能解释在癌症进展期间如何实现启动子甲基化的变化等级。每一个CpG 岛是独立运作，但是表明CpG 岛甲基化，其转录起始位点下游的DNA 区域中发生CpG 岛甲基化会更加频繁，程度也随着肿瘤恶性度增高而不断加深，并且肿瘤增长速度也会越快，如果检测非浸润性乳头状瘤的基因甲基化改变更频繁，这种肿瘤更可能发展为侵袭性疾病，这也在分子水平解释为什么癌症分子突变存在级联现象。

使用QRT-PCR 检测了永久化膀胱上皮细胞系（SV-HUC）和3 种膀胱癌细胞系PITX2 启动子甲基化程度，高恶性度的T24 细胞系显示其甲基化程度比低恶度膀胱癌细胞系（EJ、5637）要高。虽然检测PITX2 启动子甲基化中，膀胱癌细胞系比永生化膀胱上皮细胞系高几十到一百多倍，但是在检测PITX2 表达时发现，这一差异又增高了将近4 倍，癌组织与癌旁正常组织中PITX2 表达差异更加明显。这说明PITX2 甲基化可能促进PITX2 的表达。免疫组化同时显示PITX2 蛋白水平上表达，无论在细胞中还是组织中，癌中表达均高于正常膀胱细胞或组织。在成釉细胞癌中，PITX2 作为Wnt/β-catenin 途径下游调节信号，其高表达诱导肿瘤增长，作为肌动蛋白-肌球蛋白重组反应上游调节信号促进肿瘤侵袭[18]。在宫颈癌中，PITX2 与HPV E6 蛋白结合并抑制细胞中p53 的降解，从而导致p53 积聚和细胞周期阻滞于G1/G0 期，通过抑制肿瘤细胞凋亡促进肿瘤增长[19]。在淋巴结阳性结直肠癌中，β-catenin/LEF1/PITX2 复合物能够激活LEF1 表达，近而激活上皮基因FN1 促进纤维蛋白合成，这一蛋白主要促进肿瘤细胞的迁移[20]。在膀胱癌中，Wnt/β-catenin途径在促进肿瘤增殖、侵袭和迁移中早已占有一席之地，其调节PITX2 的高表达，并调节下游Cyclin-D1 和C-myc 发挥作用，但PITX2 高表达是否与其甲基化有关，还需要更深一步研究。

QRT-PCR 检测33 例膀胱癌患者的肿瘤组织中PITX2 启动子甲基化的表达。基于检测的数据，PITX2 启动子甲基化的表达水平在个体之间变化还是有的，并且观察到与匹配的邻近正常粘膜相比，膀胱肿瘤组织中甲基化表达显着增高。重要的是，研究表明PITX2 启动子甲基化的表达与肿瘤分级、大小和TNM 分类显着相关，并且更具侵袭性的肿瘤倾向于更高的甲基化表达，暗示PITX2 启动子区域甲基化在膀胱癌中的诊断作用。因此，采用ROC曲线来评估其在肿瘤侵袭预测中的表现。尽管特异性和敏感性结果仅支持PITX2 用于肿瘤侵袭诊断的适度功效。

研究中有人群样本量过少，随访时间不足等问题，因此，在进一步的研究中使用高甲基化或者沉默甲基化细胞系模型探索PITX2 启动子甲基化在膀胱癌功能，提高样本量和病人随访时间。探索PITX2 启动子区域甲基化是否为队列中膀胱癌患者5 年总生存的独立预后因素。明确膀胱癌中PITX2启动子甲基化在Wnt 信号通路中角色。总之，笔者的研究首次表明PITX2 启动子甲基化与膀胱肿瘤侵袭、TNM 分类等相关，可能预测膀胱癌的发生和总体存活率。