TauT 转基因大鼠的构建及鉴定

齐浩铭，仝慧慧，范维佳，王 辰，莫丽冬，徐立霞，么秀华，黄慧玲

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.南开大学附属环湖医院，天津市神经外科研究所，天津市脑血管与神经变性重点实验室，天津300350）

牛磺酸（Taurine，Tau），又称2-氨基乙烷磺酸，是体内丰富存在的β-氨基酸，占人体总质量的约0.1%，在体内以自由状态存在，是一种调节机体正常生理活动的非蛋白氨基酸，具有维持细胞渗透压[1]、调节细胞内Ca2+浓度[2]、增强细胞膜抗氧化能力、调节脂类消化与吸收、维持机体正常发育[3]等广泛的生物学作用。Tau 在大脑、骨骼肌、心脏、肝脏和视网膜有非常高的含量，通常高达20～43 mmol/L[4]。人体所需的牛磺酸有两条主要来源，一是在体内由肝脏中的甲硫氨酸和半胱氨酸生物合成，二是由体外食物摄取，食物摄取为补充牛磺酸的主要方式，要维持细胞内的高浓度Tau，主要是通过牛磺酸转运体的转运得以实现。

牛磺酸转运体（Taurine transporter，TauT）是由SlC6A6基因编码的一种Na+、CI-依赖性膜转运蛋白，具有12 个疏水跨膜结构域[5]。TauT 在神经系统中广泛分布，具有保障细胞的正常体积，维持细胞稳态[6]；促进大脑生长发育等作用。有研究显示[7]，TauT 在小鼠胚胎的神经前体细胞中表达活跃，其活性的上调增强了牛磺酸Na+/CI-依赖的转运途径，使牛磺酸可以有效地在细胞内大量积累，促进神经前体细胞的增殖。

哺乳动物体内的TauT 具有高度同源性[8]。为了更好地研究TauT 和Tau 在某一疾病中的作用机制，以往的研究方法主要是通过实验动物的体外给与Tau 或阻断TauT 活性的给药方式，稳定性较差。本研究采用神经系统特异性启动子PDGF 启动子，利用转基因技术构建了在中枢神经系统特异性表达TauT 的转基因SD 大鼠（TauT+/-大鼠）并进行鉴定和繁殖，为后续研究Tau 及TauT 在神经系统疾病中的作用和机制提供理想的模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 TauT+/-大鼠委托中国医学科学院北京实验动物研究所进行构建 [SCXK 京2013-0002]，转基因大鼠及野生型大鼠饲养和繁殖于中国医学科学院放射医学研究所屏障环境[SYXK 津2014-0002]，所有大鼠于温度（22～27 ℃）和湿度（50%～60%）的环境中饲养，12 h 的光/暗循环并给予足量饲料及水源。所有程序操作均符合实验动物伦理学要求，动物实验伦理审查证明编号：DWLL-20180916、DWLL-20180917。

1.2 实验材料 EasyPure Genomic DNA kit（北京全式金生物技术有限公司，EE101-12），Genstar2×Taq PCR StarMix with Loading Dye（深圳辉诺生物科技有限公司，A112-10），RNA simple Total RNA kit、反转录试剂盒、SYBR 法荧光定量PCR 试剂盒（北京天根生物科技有限公司，DP419、KR118、FP205）、高效RIPA 裂解液（索莱宝，R0010）、pmsf 蛋白酶抑制剂（美国Thermo，36978）、TauT 一抗（美国Santa Cruz，sc-166640）、β-actin 一 抗（博 奥 森 生 物，bs-10966R）、辣根酶标记山羊抗鼠二抗、辣根酶标记山羊抗兔二抗（中杉金桥，ZB-2305、ZB-2301）；Fusion x7 凝胶成像系统（Syngene，美国）、高速冷冻离心机（Beckman，美国）、实时荧光定量PCR 仪（Roche LightCycler 480，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 TauT+/-大鼠的构建 于NCBI 网站找到TauT基因（Slc6a6solute carrier family 6，Gene ID:29464），将其CDs 扩增后插入至pPDGF4（+）质粒的NheI 和XbaI 之间，构建含有神经特异性启动子PDGF-B 驱动大鼠Slc6a6基因表达的真核表达载体pDGF4(+)-Slc6a6。转基因载体用PvuI 酶切线性化后（线性化位点CGAT/CG 1:5129）调整浓度至5 ng/μL，用显微注射法将上述线性化片段注射入SD 大鼠受精卵内，经短暂体外培养后筛检存活胚胎移植入假孕受体大鼠输卵管,待其自然产下新生大鼠F0 代。

1.3.2 PCR 鉴定TauT+/-大鼠基因型 转基因大鼠出生10~12 d 用剪趾法编号，收集剪下的脚趾组织，使用全式金（Transgen）公司基因组DNA 提取试剂盒提取大鼠基因组DNA，经Genstar 试剂盒PCR 扩增后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测转基因大鼠基因型。PCR 反应体系20 μL，反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成：上游引物5′-GGTGCATTCCTCATACCGTATTTTA-3′；下游引物5′-GGCGGCTGATGTTAGGGTAC-3′。阳性杂合子（TauT+/-大鼠）的PCR扩增产物为625bp 的DNA 片段；阴性大鼠（TauT-/-大鼠）无此带。

1.3.3 TauT+/-大鼠的繁育 将F0 代TauT+/-大鼠与野生型大鼠1：1 合笼交配，繁殖得到F1 代大鼠，DNA 鉴定筛选TauT+/-大鼠，幼鼠三周离乳后雌雄分笼饲养。待F1 代大鼠长至2 月龄左右，将同一父本母本的F1 代大鼠TauT+/-大鼠雄性与雌性1：1 合笼，以期产生更多阳性F2 代大鼠。

1.3.4 一般情况的观察 每周更换2 次垫料，观察大鼠精神状态、毛色、运动、进食等多个方面情况并拍照。记录大鼠2～8 月龄时的体质量并绘制成生长曲线。记录大鼠合笼后的死亡率及阳性率。

1.3.5 TauT+/-大鼠脏器质量和脏器系数的测定 取5 月龄TauT+/-大鼠和TauT-/-大鼠，禁食12 h，麻醉大鼠后断颈处死，取大鼠大脑、小脑、心、肺、肝、肾、脾、胰腺、骨骼肌等器官，剔除表面残余脂肪与筋膜，生理盐水充分洗净并吸干水分后进行称重，按照公式计算脏器系数（脏器系数=脏器质量/体质量×100%）和脏脑系数（脏脑系数=脏器质量/脑质量×100%）。

1.3.6 TauT+/-大鼠大脑组织Slc6a6基因的RT-PCR检测 取F1 代5 月龄TauT+/-大鼠和TauT-/-大鼠大脑组织，匀浆后取100 mg，使用RNA simple Total RNA kit 试剂盒提取大脑组织的总RNA，反转录成cDNA，SYBR 法荧光定量PCR 检测Slc6a6基因的mRNA 表达水平。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40 个循环，最后72 ℃延伸5 min。样本目的基因的相对表达量计算公式为：相对表达量=2-△△Ct（△Ct=

Ct1-Ct2；Ct1：样品目的基因的临界循环数；Ct2：样品管家基因的临界循环数。△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct 的平均值）。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，上游引物5′-GAGGTCATCATAGGCCAGTAC -3′ ； 下 游 引 物 5′ - GTACACAT TCAGGAGGGACAC-3′，扩增产物长度为120 bp，GAPDH 为内参，上游引物5′-AACTCCCATTCTTCCACC-3′；下游引物5′-ACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，扩增产物长度为100 bp。

1.3.7 Western blot 检测TauT+/-大鼠大脑、心脏、肝脏组织的TauT 蛋白表达 取5 月龄TauT+/-大鼠及TauT-/-大鼠的大脑、心脏、肝脏组织，匀浆后分别取100 mg，加入含5%PMSF 的RIPA 蛋白裂解液并进行蛋白定量后，取100 μg 蛋白于10%SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离蛋白，将蛋白转移到0.45 μm 的PVDF 膜上，置于5%脱脂奶粉中封闭2 h 后加入一抗4 ℃孵育过夜，TauT 蛋白一抗（稀释浓度1：200），内参β-actin 一抗（稀释浓度1：10 000）。次日加入二抗（TauT 与β-actin 二抗的稀释浓度均为1：10 000）孵育后，使用凝胶成像仪对PVDF 印迹膜进行显影扫描蛋白条带的灰度值，并对结果图像进行定量分析，TauT 蛋白的表达水平为TauT 与β-actin的比值（TauT/Actin），各组样本的TauT 蛋白数据归一化后进行比较分析。

1.3.8 免疫组化检测TauT+/-大鼠大脑组织TauT 蛋白的表达 取5 月龄TauT+/-大鼠及TauT-/-大鼠，左心室灌注后,取脑组织放入10%中性福尔马林溶液，固定，脱水，包埋制成4 μm 厚石蜡切片，将石蜡切片脱蜡后经苏木精-伊红染色后制成HE 染色树脂片；或脱蜡后加入TauT 蛋白一抗（稀释浓度1：200）后37 ℃孵育2 h，PBS 冲洗后加入二抗（辣根酶标记山羊抗鼠，稀释浓度1：10 000），最后经DAB 显色，苏木精复染，脱水，制成免疫组化染色树脂片，利用Leica BOND-Ⅲ全自动免疫组化仪进行常规染色，光学显微镜下观察并进行结果分析。每张切片随机选取3 个200 倍视野，使用Image pro plus（IPP）图像分析软件进行半定量分析并计算目的蛋白平均光密度（IOD/Area）。

1.4 统计学方法 利用SPSS17.0 软件和GraphPad Prism 6 对数据进行处理，数据结果采用x±s 表示，组间数据采用独立样本t检验进行分析，当P＜0.05时有显著性差异。

2 结果

2.1 TauT+/-大鼠的构建 将Slc6a6cDNA 重组到PDGF4（+）的NheI 和XbaI 之间构建PDGF-Slc6a6表达质粒（图1），用PvuI 酶切线性化载体。用显微注射法将上述线性化片段注射入SD 大鼠受精卵内，制备转基因大鼠，共获得3 只TauT+/-大鼠首建鼠（F0 代：4#、9#、11#）。

图1 PDGF-Slc6a6 重组质粒构建Fig 1 Establish of the transgene expression vector of PDGF-Slc6a6

2.2 PCR 鉴定TauT+/-大鼠结果 电泳结果见图2，F0 及F1 代TauT+/-大鼠扩增产物为625 bp 的DNA片段，与预期片段位置相符，转基因大鼠DNA 遗传稳定，TauT-/-大鼠和WT 大鼠没有条带。

图2 TauT+/-大鼠DNA PCR 鉴定Fig 2 Results of genetype identification TauT+/-rat by PCR

2.3 TauT+/-大鼠繁殖情况 繁殖情况见表1，F0 代（4#、9#、11#）共繁育6 次：4#未生育，9#繁育2 次，后代均为阴性；11#繁育4 次，F1 代的阳性率为44.07%，基本符合孟德尔遗传定律，故选择11#F0 代及其后代进行繁育。F0 代和F1 代共繁育出174 只大鼠，死亡22 只，其中TauT+/-大鼠63 只，TauT-/-大鼠111 只，阳性率36.21%，死亡率3.7%。

2.4 TauT+/-大鼠一般情况的观察 如图3、4 所示，TauT+/-大鼠与TauT-/-大鼠毛色光滑，精神健康，并未出现饮食上的异常，无脱毛萎靡情况，在体型上无明显差别，体质量也无明显差异。

2.5 TauT+/-大鼠脏器质量和脏器系数的测定 脏器质量和脏器系数的测定结果见表2，与TauT-/-大鼠比较，TauT+/-大鼠的肝体、肾体系数显著下降（P＜0.05），但脏脑系数均无显著性差异，总趋势是：与TauT-/-大鼠比较，TauT+/-大鼠各项脏器指标均无显著性差异。

2.6 TauT+/-大鼠大脑组织Slc6a6基因的RT-PCR检测 如图5～7，RT-PCR 结果表明TauT+/-大鼠在大脑组织中的Slc6a6基因mRNA 表达水平较TauT-/-大鼠显著升高（P＜0.05），融解曲线显示只有内参基因GAPDH 和Slc6a6基因的融解峰，扩增产物分别在81 ℃和85 ℃时出现单一峰，扩增特异性较好。

表1 TauT+/-大鼠繁育结果Tab 1 Reproduction of F0-F1 generation of the TauT+/-and TauT-/-rats

图3 TauT+/-大鼠外观一般观察Fig 3 The general status of TauT+/-rats

表2 TauT+/-大鼠和TauT-/-大鼠脏器质量、脏器系数、脏脑系数的比较Tab 2 Results of organ weight,organ coefficient and organ/brain ratio of the TauT+/-and TauT-/-rat

图5 TauT+/-大鼠大脑组织Slc6a6 mRNA 表达水平情况Fig 5 Expression of Slc6a6 mRNA in the brain of the TauT+/- and TauT-/-rat

图6 RT-PCR 扩增曲线Fig 6 Amplification curve of RT-PCR

图7 RT-PCR 融解曲线Fig 7 Melting curve of RT-PCR

图8 免疫印迹检测TauT+/-大鼠大脑、心脏、肝脏TauT 蛋白表达水平Fig 8 The protein expression level assay of TauT protein in the brain,heart and liver of the TauT+/-and TauT-/-rat by Western blot

图9 TauT+/-大鼠大脑、心脏、肝脏TauT 蛋白表达水平柱状图分析Fig 9 The protein expression level assay of TauT protein in the brain, heart and liver of the TauT +/- and TauT -/- rat by histogram analysis

2.7 Western blot 检测TauT+/-大鼠大脑、心、肝组织TauT 蛋白的表达 结果如图8～9 所示，与TauT-/-大鼠比较，TauT+/-大鼠在大脑、心、肝中TauT 蛋白表达均无显著性差异（P＞0.05）。

2.8 TauT+/-大鼠大脑组织海马与皮层HE 染色和免疫组化结果 HE 染色免疫组化结果如图10、11 所示，TauT+/-大鼠与TauT-/-大鼠海马区与皮层处的细胞排列紧密且规则，细胞形态正常，未见肿胀。IPP软件光密度分析及t检验显示TauT+/-大鼠与TauT-/-大鼠在大脑皮层和海马区TauT 的表达情况无显著差异（P＞0.05）。

图10 TauT+/-与TauT-/-大鼠大脑皮层和海马区免疫组化和HE 染色结果比较（200x）Fig 10 Comparison of immunohistochemical and HE staining results between brain cortex and hippocampus in TauT+/-and TauT-/-rat(200x)

图11 TauT+/-与TauT-/-大鼠大脑皮层和海马区免疫组化光密度对比分析Fig 11 Comparison between optical density of brain cortex and hippocampus in TauT+/-and TauT-/-rat

3 讨论

大鼠作为常用的实验动物，除了体型较大可易于手术操作、形态观察之外，在生理、代谢等方面也更为接近人类[9]，尤其在研究神经系统相关疾病[10-11]和抑郁焦虑样行为[12]中具有较大优势。笔者团队制作的TauT+/-大鼠是通过显微注射技术将PDGFSlc6a6基因随机整合到基因组中的，该技术的优点是实验周期较短，整合效率较为稳定，且导入的外源基因片段大小不受限制[13]，但基因整合的拷贝数及位点未知，通常是多拷贝，且由于不同首建鼠插入的位点及拷贝数不同，而导致不同F0 代大鼠之间目的基因表达有差异，因此需要筛选出高表达且稳定遗传的大鼠进行传代。本实验中4#转基因首建鼠不育，9#转基因首建鼠繁育2 窝均为阴性，11#转基因首建鼠繁育4 窝，阳性率为44.07%，基本符合孟德尔遗传定律，故选择11#首建鼠及其后代进行繁育。

大鼠的体质量和生存情况是衡量大鼠表型变化的重要参数，冯颖等[14]报道向Wistar 大鼠喂食含有牛磺酸的饲料未影响其体质量，但喂食牛磺酸转运体抑制剂β-丙氨酸可以显著降低大鼠体质量。笔者在繁殖TauT 转基因大鼠的过程中，发现TauT+/-大鼠与TauT-/-大鼠在体质量、毛发、进食、活动等方面均无明显差异，表明插入TauT 基因未对大鼠造成外在表型的影响，这与其报道结果相似。实验动物脏器质量、脏器系数和脏脑系数的变化可反映出毒物或插入基因对实验样本及其脏器的综合效用[15]，本研究发现：相比于TauT-/-大鼠，TauT+/-大鼠的肝体、肾体系数显著降低（P＜0.05），提示插入TauT 基因可能会对SD 大鼠的肝脏和肾脏有影响，但因其它脏器系数无显著性差异，而且各脏器的脏器质量、脏脑系数均没有显著性差异，综合来看，TauT+/-大鼠的脏器水平与TauT-/-大鼠无显著性差异。有研究显示[16]，长期补充牛磺酸会导致肾脏质量的增加并伴随着肾脏重吸收作用及肾小球滤过作用紊乱的情况，具体机制不明确。笔者也将会增加TauT+/-大鼠的数量以密切关注其肝脏和肾脏的变化情况。

神经特异性启动子是一类在神经系统中特异性表达的启动子，在转基因技术中它经常与目的基因连接后导入受精卵，用于研究神经系统疾病的相关机制[17]，神经特异性启动子的优势在于确保在所需神经细胞中发挥高表达效果的同时，避免其它细胞中相关基因表达所引起的副作用[18-19]。血小板源性生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）的启动子PDGF 可以在整个脑和脊髓的神经元中高表达，但在神经胶质细胞中没有活性，是一种应用广泛的神经特异性启动子[20-21]。本实验中结果显示，与TauT-/-大鼠相比，TauT+/-大鼠大脑组织中Slc6a6mRNA 表达水平显著升高，其它脏器（心、肝）比较无差异性（实验数据未列出），而大脑、心、肝等脏器的TauT 蛋白表达稳定，无显著差异性，免疫组化和HE 染色也显示TauT+/-大鼠在海马与皮层区TauT蛋白的表达均没有显著差异，说明转入PDGFSlc6a6基因片段可以提高大鼠TauT mRNA 表达水平，而未能改变大鼠大脑组织TauT 蛋白的表达水平，从某种角度上说，即利用脑特异性启动子PDGF与Slc6a6基因连接后转入大鼠体内，只能在基因水平上对大鼠大脑组织有所改变，未能提高大脑组织中TauT 蛋白表达能力，出现这种基因和蛋白表达不一致的情况，推测是转入的PDGF-Slc6a6基因片段对后期的基因翻译水平调节未能达到其蛋白表达的检测程度，具体机制尚不明确，有待后续实验进一步研究。

综上所述，本研究通过显微注射技术将PDGFSlc6a6基因序列整合到SD 大鼠体内构建TauT+/-大鼠，为各种神经疾病的研究提供了较好的TauT 转基因动物模型，也为研究基因敲除TauT 大鼠在神经系统疾病中的机制提供了对照模型。