白芨块茎cDNA文库构建及转录组序列分析

王 宇，杨文丽，李嘉钰，向雪静，李月萍，蔡佳丽

（1.攀枝花学院附属医院，四川 攀枝花617000；2.攀枝花学院医学院，四川攀枝花617000）

白芨是多年生草本植物，属于兰科白芨属。主要分布在云南、四川、贵州、湖南、湖北、江西等省，多生长在海拔高度为950-3500 m的阔叶林下。白芨及其块茎是我国药典记录的传统中药材之一，最早在《神农本草经》中就有记载，其块茎中含有较丰富的苄类、萜类和多糖类化学成分，具有止血润肺、消肿生肌、抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病、抗菌和抗肿瘤等功效，在医药食品等领域已广泛应用［1-4］。

目前，通过构建cDNA文库和高通量转录组测序，已对多种药用植物进行分子生物学研究，挖掘出了一些重要功能基因，对于揭示不同生物学性状的分子机制具有重要意义［5］。

本研究采用高通量测序技术对白芨块茎进行转录组分析，得到白芨的重要功能基因，对其进行功能注释、分类和代谢通路分析，这为下一步研究白芨的药用成分、次生代谢等机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料

植株由攀枝花市丰盛源农林开发有限公司提供。

1.1.2主要仪器与试剂

凝胶成像系统和电泳仪购于美国伯乐公司、超微量核酸分析仪购于杭州奥盛仪器有限公司、RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1RNA提取

按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA，使用凝胶电泳和超微量核酸分析仪对其质量和浓度进行分析。

1.2.2cDNA文库的构建

首先用磁珠富集poly（A）mRNA，然后以mRNA为模板，经逆转录反应合成第一链cDNA和第二链cDNA，对双链cDNA进行纯化后再进行末端修复、加尾和加接头，片段分选以及PCR扩增，最后构建成cDNA文库，对文库质检后进行测序。

1.2.3生物信息学分析

对测序得到的原始数据用生物信息学软件进行处理，得到有效数据（Unigene序列），再将获得的Unigene序列与SwissProt、Nr、GO、KEGG和COG数据库进行比对，获得功能注释，推测基因的功能与作用。

2 结果

2.1 转录组组装分析

测序得到5624755条序列，经过组装得到130721条Unigene，N50长度为1490 bp，最短序列长度为201 bp，最长序列长15579 bp，平均长度为802 bp。在130721条Unigene中，76239条在200-500bp之间，占58.32%；21645条在500-1000 bp之间，占16.56%；11919条在1000-1500bp之间，占9.12%；8234条在1500-2000 bp之间，占6.30%；12683条大于2000bp，占9.70%（图1）。

图1 Unigene不同长度区间分布

图2 Unigene在各数据库注释分布

2.2 Unigene注释

将130721条Unigene序列通过NR、COG、Swissprot、KEGG等数据库进行比对，60827条Unigene获得注释。60033条Unigene在NR数据库中获得注释，占45.92%，30267条Unigene在COG数据库中获得注释，占23.15%；39368条在Swissprot数据库中获得注释，占30.12%；8252条在KEGG数据库中获得注释，占6.31%，见图2。

2.3 Unigene的GO分类

25820条Unigene得到GO功能注释，共分为54个小类，其中生物进程、有19个小类，主要有：信号转导、细胞调控、细胞自噬、生物调控、刺激反应、繁殖进程等；分子功能有22个小类，主要有：结构分子活性、运输活性、催化活性、营养储存活性、抗氧化活性、与蛋白质结合的转录因子活性、分子功能调控等；细胞组分有13个小类，主要有：细胞膜、突触部分、细胞外基质、大分子复合体等。

2.4 Unigene的COG分类

COG数据库是由NCBI创建并维护的蛋白数据库，通过比较大量生物的蛋白质序列对基因产物进行同源分类。将Unigene通过COG数据库后进行分类，可以分为RNA加工和修饰、细胞周期控制、防御机制等不同功能，详见图3。

图3 Unigene的COG功能分类

2.5 Unigene的KOG分类

30267条Unigene得到GO功能注释，可分为26类；其中参与“一般功能预测”（General function prediction only）的转录物最多，有4286个，占 14.16%；第二为参与“信号传导机制”（Siganl transduction mechanisms）的转录物，有3733个，比例为12.33%。此外，还包括核酸运输代谢、RNA组装修饰、糖类运输代谢、辅酶运输代谢、脂类运输代谢、能量生产转化等多数生理生化过程。

2.6 KEGG代谢分析

KEGG代谢途径分析表明，1916条Unigene参与了葡萄糖、果糖、半乳糖等多种糖类代谢，1320条Unigene参与了多种氨基酸代谢；185条Unigene参与了萜类和酮类化合物的代谢，此外，参与脂类、核酸、能量等代谢类型的Unigene有9194条；1147条Unigene参与了各种细胞和组织系统（如运输与分解代谢）进程，4259条Unigene参与了遗传物质（如折叠、分类和降解）和环境信息（如信号转导）的处理和加工过程。

2.7 白芨多糖的关键酶

白芨胶质的主要成分为白芨多糖，以葡萄糖和甘露聚糖为主，找到相关合成的酶基因，有利于阐明白芨胶质多糖的生物合成与分解途径。本研究发现了有关白芨多糖合成的多个酶基因，如β-葡萄糖苷酶、β-葡糖醛酸基转移酶、α-甘露糖苷酶、磷酸异构酶、6-磷酸果糖激酶等，这些酶基因都参与了糖代谢途径。

2.8 微卫星DNA序列分析

微卫星DNA序列就是简单重复序列，广泛分布于真核生物的基因中，可以作为优良的遗传标记。在白芨中发现39585个星位点，以单核苷酸、双核苷酸和三核苷酸三种类型为主，单核苷酸的基序为A/T/C，二核苷酸基序为AT/AG/CT，三核苷酸的基序为TTC/ATC/CGG。

3 讨论

白芨块茎含有丰富的多糖，具有诱导免疫调节因子表达、增强天然杀伤性细胞活性等免疫功能，因此可以开发为抗肿瘤药物或者化妆品添加物［6］。此外，白芨块茎中含有萜类、甾类以及联苄类物质，研究表明白芨萜类及其衍生物具有抗血管生成，诱导血管内皮细胞凋亡的作用。目前，将白芨的化学成分和药理研究结合起来，对研制新药具有广阔的应用前景［7］。

本研究通过对白芨的转录组进行分析，找到了大量参与白芨多糖和萜类合成与代谢相关的基因，这为研究白芨的药用成分、次生代谢具有重要意义。同时，通过对微卫星DNA序列分析可为白芨的遗传多样性和分子标记辅助育种奠定基础。