离子色谱法与国标高效液相色谱法对婴幼儿配方乳粉中糖类的测定分析

曹文军，李 莉，薛伟锋*，刘 明

（1.中国检验认证集团辽宁有限公司，辽宁 大连 116600；2.大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116600；3.大连海关技术中心，辽宁 大连 116600）

乳粉中的糖类是婴幼儿的能量来源，通常分为天然糖和添加糖，乳粉中天然糖的添加对健康有益，而添加过多只会增加热量，不能为婴幼儿提供全面的营养要素，甚至会造成婴幼儿营养不良、肥胖、注意力不集中及增加龋齿发生机会等。因此，建立婴幼儿配方乳粉中糖类含量的检测方法至关重要。

乳粉中的糖类主要以单糖、双糖和低聚糖的形式存在。乳粉中多种糖类的定性及定量检测方法有气相色谱-质谱联用法[1-2]、酶解法[3]、气相色谱法[4-5]、高效液相色谱法[6-7]、毛细管电泳法[8-9]、液相色谱-质谱法[10-12]和离子色谱法等[13-15]，这些方法均存在前处理操作繁琐、灵敏度低、分析时间长、分析目标物种类较少等问题。国家标准对糖类的检测主要采用高效液相色谱法，在对样品进行前处理后，选取不同的色谱柱和流动相，受检测器（示差折光检测器或蒸发光散射检测器）的影响，对糖类的分析灵敏度相对较低。针对复杂的婴幼儿配方乳粉样品基质，高分辨质谱在灵敏度和抗干扰能力方面表现出优势，成为未来乳粉中糖类检测的重要发展趋势[10-12]，结合优化梯度洗脱程序的离子色谱-电化学检测法[16-17]在糖类分析中表现出分离效果好、灵敏度高和选择性强等特点[18-19]，已被美国分析化学家协会等机构广泛应用于食品分析检测[20]。因此，建立可靠、快速的同时检测多种糖类的定性及定量方法极为重要。

本研究试图建立离子色谱法测定婴幼儿配方乳粉中多种糖类的方法，并与国标方法中的高效液相色谱法进行比较，为婴幼儿配方乳粉标准的科学制定、产品的质量控制提供一种新的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氢氧化钠溶液（质量分数50%） 美国Alfa Aesar公司；醋酸钠（优级纯，纯度＞99.9%） 美国Thermo Scientific公司；乙腈溶液（优级纯） 德国Merck公司；蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准品（纯度均＞99.9%） 日本Wako公司；葡萄糖、乳糖、蔗糖标准品（纯度均＞99.5%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖五糖标准品（纯度均＞99.9%） 美国Anpel公司。

1.2 仪器与设备

ICS-5000离子色谱仪（配备GS50四元梯度泵、AS-DV自动进样器（进样量25 µL））、ED50电化学检测器（配有金电极、pH-Ag-AgCl参比电极、四位波形电位和钛对电极）、PeakNet 6.8色谱工作站、色谱柱：Thermo Scientific Carbopac PA20阴离子交换柱，包括分析柱（3 mm×150 mm）和保护柱（3 mm×30 mm）、0.22 µm水相微孔滤膜、OnGuard RP小柱 美国Thermo Scientific公司；H-class高效液相色谱仪（配备蒸发光检测器）、Acquity UPLC®BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm） 美国Waters公司；超纯水系统 德国Sartorius公司；KQ-700DV数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH-J8水浴磁力搅拌器 江苏省金坛市精达仪器制造有限公司；Z-323K离心机 德国Hermle公司；BSA822电子天平 北京赛多利斯天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

200 mmol/L氢氧化钠溶液的配制：准确量取10.6 mL质量分数50%氢氧化钠溶液，置于流动相瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，瓶内充高纯氮气，摇匀上机备用。

l mol/L醋酸钠溶液的配制：准确称量82.04 g醋酸钠，置于流动相瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，瓶内充高纯氮气，摇匀上机备用。

蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚半乳糖三糖及低聚半乳糖五糖混合标准液的配制：分别准确称量以上标准品0.1 g置于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，摇匀备用，各物质质量浓度均为1 000 mg/L。

所用水均为电阻率为18.2 MΩ·cm的超纯水。

1.3.2 样品测定

离子色谱法：称取乳粉样品0.200 g，置于20 mL容量瓶中，加超纯水8 mL，混匀超声20 min使其溶解，80 ℃水浴20 min，冷却至室温后，加乙腈定容，充分摇匀，10 000 r/min离心15 min；取上清液过0.22 µm水相滤膜及OnGuard RP小柱，弃去前8 mL滤液，然后稀释100 倍上机测定。

高效液相色谱法：分别按照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》[21]中6.1节与GB/T 23528—2009《食品安全国家标准 低聚果糖》[22]中6.5.4节操作。

1.3.3 离子色谱法测定

离子色谱法测定糖类物质是通过将其在碱性淋洗液中离子化后在阴离子交换柱上进行分离，选用CarboPac PA20阴离子交换柱，包括分析柱（3 mm×150 mm）和保护柱（3 mm×30 mm），PA型柱填充树脂是无孔基质，主要用于非还原糖化合物的分析。色谱条件为：使用200 mmol/L NaOH与1 mol/L NaAc作为流动相，柱温30 ℃，流速0.3 mL/min，积分安培检测器检测。积分工作电位波形设定如表1所示，梯度洗脱程序如表2所示。

表1 工作电位波形设定表Table 1 Working electric potential waveform settings

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

1.3.4 蔗果五糖溶出量测定

标准曲线制作：分别吸取1 000 mg/L蔗果五糖标准溶液5、10、25、50、100、250 mL，加入2 L容量瓶，用超纯水定容，制得溶液质量浓度分别为2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、125.0 mg/L。以峰面积为纵坐标，蔗果五糖标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，曲线方程为y=3.188 7x+4.531 5（R2=0.998 5）

本研究涉及的8 种糖物理性质相似，水溶性差异小，因此，选取蔗果五糖代替总糖，测定其溶出量，具体方法如下：称取乳粉0.200 g，加入12 mL乙腈除蛋白，再用超纯水定容至2 L，于40 kHz超声波条件下提取后10 000 r/min离心15 min；取上清液过0.22 µm水相滤膜及OnGuard RP小柱，进入离子色谱仪进行分析。根据蔗果五糖的标准曲线计算溶出量。

1.4 数据处理

离子色谱测定结果采用Chromeleon软件、高效液相色谱测定结果采用Empower软件分别进行样品数据的批处理分析。

2 结果与分析

2.1 离子色谱法测定结果

2.1.1 乳粉中糖类的提取条件优化

糖类是水溶性物质，易溶于水，并且随着温度升高糖类在水中溶解度增大，因此采用超纯水对乳粉样品进行提取。为获得较好的提取效果，先采用超声提取的方式促进乳粉溶解，再采用高温水浴加速乳粉中的糖类溶解，由于高温水浴的作用，乳粉中的部分蛋白质也被沉淀，在一定程度上降低了干扰。样品超声提取时间以及水浴温度和时间通过实验确定。乳粉样品经过以上处理后仍有残渣，可在10 000 r/min转速下离心15 min，以除去不溶物，使乳粉溶液澄清，取上清液过0.22 µm水相微孔滤膜与OnGuard RP小柱，待上机分析。通过考察超声提取时间、水浴温度和水浴时间对蔗果五糖溶出量的影响，获得最优的糖类提取条件。

被分析的8 种糖物理性质相似，水溶性差异小，因此以蔗果五糖的溶出量代表其他被测糖类的溶出量。

图1 超声提取时间对蔗果五糖溶出量的影响Fig. 1 In fluence of sonication time on the amount of dissolved 1F-fructofuranosyl nystose

由图1可知，超声20 min后，蔗果五糖溶出量不再增加，认为乳粉中所含糖类已基本全部溶出。因此，选择20 min作为乳粉中糖类的超声提取时间。

图2 水浴温度对蔗果五糖溶出量的影响Fig. 2 In fluence of water bath temperature on the amount of dissolved 1F-fructofuranosyl nystose

图3 水浴时间对蔗果五糖溶出量的影响Fig. 3 In fluence of water bath incubation time on the amount of dissolved 1F-fructofuranosyl nystose

由图2～3可知，随着水浴温度的提高，蔗果五糖溶出量增加。水浴温度80 ℃以上、水浴时间20 min之后，蔗果五糖溶出量不再增加，认为此时乳粉中的糖类已全部溶出。因此，选择水浴温度80 ℃、水浴时间20 min。

2.1.2 沉淀剂的选择

乳粉中含有大量蛋白质和脂肪，需在进入色谱柱之前除去，一般蛋白沉淀剂选用盐、酸、乙醇或乙腈。离子色谱柱是离子型交换柱，在乳粉的整个前处理过程中，要尽可能地减少其他离子带入，避免对实验结果产生干扰，因此不可用盐来沉淀乳粉蛋白质。此外，CarboPac PA20色谱柱（包含分析柱和保护柱），其基质和乳胶粒度、柱容量均较小，因此，用酸作为沉淀剂也不合适，并且强酸对部分双糖和低聚糖有分解作用。乙醇对蛋白质的沉淀能力不强，因此选用乙腈作为蛋白质沉淀剂，在0～4 ℃条件下沉淀10 min左右即可。

2.1.3 OnGuard RP柱对乳粉中糖类回收率的影响

OnGuard RP柱是一种反相固相萃取小柱，通常用来除去处理后溶液的大分子，也可除去样品中的疏水性化合物，主要去除色素、蛋白质和脂类，是离子色谱法最常选择的样品前处理方式之一。由于糖类极性强，在固相萃取小柱上没有保留，而色素、蛋白质和脂类物质等相对于测定组分疏水性较强，容易保留在固相萃取小柱上，经过固相萃取小柱后可通过分离除去色素、蛋白质和脂类物质，有效降低基质干扰。

针对OnGuard RP小柱是否有利于多种糖类的分析进行实验。OnGuard RP小柱使用前依次用8 mL甲醇和8 mL超纯水活化后，静置15 min使用。未使用OnGuard RP小柱条件下，将葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、蔗果三糖、低聚半乳糖五糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合标准溶液上机重复进样3 次，计算求得峰面积平均值，结果如表3所示；使用OnGuard RP小柱条件下，将上述混合标准溶液过微孔滤膜和OnGuard RP小柱，弃去前8 mL滤液，上机重复进样3 次，计算求得峰面积平均值，结果如表4所示。比较使用OnGuard RP小柱前后测定结果的差异。

表3 未使用OnGuard RP小柱时各目标物峰面积Table 3 Peak area of each target compound without use of OnGuard RP column nC×min

由表3～4可知，葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、蔗果三糖、低聚半乳糖五糖、蔗果四糖、蔗果五糖的回收率约为100%，说明OnGuard RP小柱未对8 种糖产生吸附。因此，使用OnGuard RP小柱进行样品前处理。

表4 使用OnGuard RP小柱时各目标物峰面积和方法回收率Table 4 Peak area and recovery of each target compound with use of OnGuard RP column

2.1.4 精密度实验结果

选取某一品牌乳粉样品，按照1.3.2节的处理方法进行处理，然后进样分析。

表5 8 种糖的含量测定结果精密度Table 5 Precision for replicate determinations of contents of 8 sugars

表6 保留时间测定结果精密度Table 6 Precision for replicate measurements of retention times of 8 sugars

由表5～6可知，8 种糖的含量及保留时间测定结果的RSD均小于4.0%，表明方法精密度良好，重复性好。

2.1.5 标准曲线、检出限与测定限

用3 倍信噪比和10 倍信噪比分别计算8 种糖的检出限和测定限，标准曲线、检出限与测定限测定结果如表7所示。

表7 标准曲线、检出限与测定限Table 7 Standard curves, detection limits and determination limits

2.1.6 加标回收率测定结果

由于乳粉本身乳糖含量太高，不宜用乳粉进行回收率实验，因此采用豆浆进行加标回收率实验。

表8 加标回收率测定结果Table 8 Recoveries of spiked samples

由表8可知，该方法测定豆浆样品中8 种糖类的加标回收率为78.0%～96.8%，说明方法准确度较高、检测方法可行。

2.1.7 样品测定结果

图4 乳粉A中糖类的离子色谱图Fig. 4 HPAEC chromatogram of sugars in sample A

图5 乳粉B中糖类的离子色谱图Fig. 5 HPAEC chromatogram of sugars in sample B

图6 乳粉C中糖类的离子色谱图Fig. 6 HPAEC chromatogram of sugars in sample C

图7 乳粉D中糖类的离子色谱图Fig. 7 HPAEC chromatogram of sugars in sample D

对4 种市售不同品牌（A、B、C、D）的婴幼儿配方乳粉进行测定，离子色谱图和测定结果分别如图4～7和表9所示。

表9 4 种品牌乳粉离子色谱法测定结果Table 9 Sugar contents of four infant formula samples determined by HPAEC g/100 g

由表9可知，离子色谱法只有蔗糖和蔗果三糖未检出，其他6 种糖类均有检出。

2.2 高效液相色谱法测定结果

GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》[21]规定了高效液相色谱法检测食品中葡萄糖、蔗糖、乳糖含量的方法，GB/T 23528—2009《食品安全国家标准 低聚果糖》[22]规定了高效液相色谱法检测低聚果糖含量的方法，但对低聚半乳糖的检测没有国家标准方法，因此，选用高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中葡萄糖、蔗糖、乳糖及低聚果糖的含量，并与离子色谱法测定结果进行比较。

2.2.1 标准溶液测定

高效液相色谱法测定多种糖混合标准溶液时，各物质质量浓度低于20 mg/L时，6 种糖无法完全出峰，质量浓度高于500 mg/L时，乳糖等会出现平头峰，不利于检测。因此，配制的多种糖混合标准溶液中6 种糖各物质质量浓度分别为50、100、150、200、400 mg/L。质量浓度100 mg/L时的分离图谱如图8所示。

图8 高效液相色谱法分析100 mg/L标准糖混合液的分离图谱Fig. 8 HPLC chromatogram of 100 mg/L standard sugar mixture

2.2.2 样品测定结果

对2.1.7节的4 种市售不同品牌（A、B、C、D）婴幼儿配方乳粉进行测定，高效液相色谱图和测定结果分别如图9～12和表10所示。

图9 乳粉A中糖类的高效液相色谱图Fig. 9 HPLC chromatogram of sugars in sample A

图10 乳粉B中糖类的高效液相色谱图Fig. 10 HPLC chromatogram of sugars in sample B

图11 乳粉C中糖类的高效液相色谱图Fig. 11 HPLC chromatogram of sugars in sample C

图12 乳粉D中糖类的高效液相色谱图Fig. 12 HPLC chromatogram of sugars in sample D

表10 4 种品牌乳粉高效液相色谱法测定结果Table 10 Sugar contents of four infant formula samples determined by HPLC g/100 g

由表10可知，高效液相色谱法只检测出4 种品牌乳粉中的乳糖含量，其他5 种糖类均未检出。

2.3 离子色谱法与国标高效液相色谱法测定结果对比

由表9～10可知：高效液相色谱法与离子色谱法检测出乳糖含量基本一致，蔗糖、蔗果三糖2 种方法均未检出；高效液相色谱法测定糖类含量的灵敏度远低于离子色谱法，4 种品牌乳粉中的葡萄糖、蔗果四糖、蔗果五糖用高效液相色谱法均未检出，而离子色谱法均有检出；国标未规定高效液相色谱法测定乳粉中低聚半乳糖三糖和低聚半乳糖五糖的方法，并且实验中也均未检出，但离子色谱能够检测其相应含量。

3 结 论

离子色谱法测定婴幼儿配方乳粉样品中多种糖类含量的RSD小于4.0%、加标回收率为78.0%～96.8%、检出限为3～12 mg/100 g，而国标高效液相色谱法中葡萄糖、蔗糖、乳糖的检出限为200 mg/100 g[21]，低聚果糖的检出限为150 mg/100 g[22]。高效液相色谱法只能检测出乳粉中的乳糖含量，且与离子色谱法测定结果基本相同，2 种方法均未检出蔗糖、蔗果三糖，高效液相色谱法未检出葡萄糖、蔗果四糖、蔗果五糖，但离子色谱法均能相应检出，说明离子色谱法分析乳粉中糖类含量的灵敏度较高。

离子色谱法测定乳粉样品的前处理时间短、成本低、可分析的糖种类多，但是上机分析时间为35 min；高效液相色谱可分析的糖种类少、上机分析时间为10 min。离子色谱法有望为婴幼儿配方乳粉标准科学制定、产品质量控制提供一种新的检测方法。